故事发生在1983年的春夏之交 很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一 Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…... Mullis的第一个PCR实验                                     1983年9月中旬。                                            Mullis在反应体系中加                                                    入DNA聚合酶后在37                                 ℃一直保温。结果第二                                 天在琼脂糖电泳上没有                                 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。 PCR的发展史 1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。 PCR不只是一个方法改进 Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”； 到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR具有极高的灵敏度 耐高温DNA聚合酶的种类 Taq  DNA聚合酶          (Thermus aquaticus，Cetus/Roche) Tth  DNA聚合酶         (Thermus thermophilus，Toyobo) Pfu DNA聚合酶        （Pyrococcus furiosus，Stratagene）         Deep Vent DNA聚合酶 (Bio-labs）  Tfl DNA聚合酶                （Thermus flavus，Promega) Tli DNA聚合酶          (Thermococcus litoralis，Promega)              Vent   DNA聚合酶 (Bio-labs）  Pwo DNA聚合酶             ( Pyrococcus woesei，Roche) Pfx DNA聚合酶  (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen) Dynazyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme） FD DNA聚合酶           (Thermus sterophilus？，复旦大学) Tma, Tne, KOD, …… PCR反应中Taq酶的选择 高特异性：热启动Taq酶-高温激活   修饰（抗体抑制剂、蜡封等）如Clongtech\stratagen等公司或重组酶，如QIAGEN公司的HotStar系列 高保真Taq酶（因其具有3”到5“核酸外切酶活性，错配率10-6，）普通Taq酶2~5×10-5碱基/循环，如Stratagene的Pfu，NEB公司的Vent DNA聚合酶， QIAGEN公司的ProofStar DNA聚合酶，兼特异性与保真性于一体 高耐热性Taq酶 NEB公司的Vent 和Deep Vent DNA聚合酶系列，从海底火山口分离后克隆的，是普通Taq酶耐热性的三倍以上，前者在95 ℃半衰期近7h，100 ℃ 近2h；后者更甚分别为23h和8h        超长片段扩增Taq酶；基因组图谱、测序及分子遗传学研究。Clontech公司的Advantage Genomic系列混有TthDNA聚合酶，Proofreading酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增10kb片段，简单模板可达40kb。 关于复杂模板的扩增  对于模板结构复杂，如GC含量高（ 60%），有二级结构等，普通的Taq酶可能难以延伸下去，加入DMSO等助溶剂可帮助扩增顺利进行，但DMSO有毒，而且用量需要优化。QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液，操作方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。 变性    使双链DNA解链为单链     95℃ 20-30秒 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 (2)退火(复性)温度与时间：     温度由引物长度和GC含量决定。     增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PC
PCR技术及PCR仪.ppt