色谱技术 色谱法的分类 一、按照固定相与流动相物态分 气相色谱： GC （GSC；GLC）  液相色谱：（LSC；LLC） 超临界流体色谱：（SFC）  二、按照固定相使用形式分 柱色谱 平面色谱 ：在平面介质上进行组分分离的技术  薄层色谱：（TLC）薄层板和薄层棒 纸上色谱：（PC）圆形纸上色谱      三、按照分离机理分类 1、吸附色谱 2、分配色谱 3、离子交换色谱：（IC） 利用离子交换树脂作固定相分离离子型化合物的色谱法。用高效掖相色谱技术和离子交换树脂柱，用含有某种特定例子的水溶液作流动相，在降低流动相背景信号的前提下进行离子分离；或通过调节流动相的pH值以抑制试样作粉的电离，从而分离离子化合物：（离子抑制色谱） 。    4、离子排除色谱：（IEC）利用离子交换树脂对电解质与非电解质的斥力不同而达到分离的色谱法。最常用的是粒径=15μm 高效凝胶型磺化苯乙烯/二乙烯苯离子交换树脂（强酸型）。树脂溶涨后在小球中溪流的水是稳定的水相，小球间是流动的水相。离子交换树脂在两个水相间起半透膜作用。试样中与离子交换树脂的离子带相同电荷的离子被排斥在固定水相之外，弱酸一分子存在被固定水相滞留；非离子组分不被滞留，在两相间进行分配，按照祖坟与树脂官能团作用力大小不同分开。  5、离子对色谱法：（IPC）在流动相中加入与所要分离的组分相反电荷的离子（称为离子对，即离子试剂），与组分形成离子对，从而改变组分的保留值和分离度。 6、凝胶色谱：空间排除色谱、分子排除色谱、分子筛色谱、液体排除色谱、体积排除色谱等（GPC）。用于大分子分离，生化中水嘴流动相成为凝胶过滤色谱；合成高聚物中用有机物作流动性成为凝胶渗透色谱。 亲和色谱  生物体内生物分子之间都具有亲和力，能形成可逆络合物，利用这种可逆络和与解离原理进行色谱分离，即把配基键和在不溶于水的惰性载体上成为亲和物从而进行提纯的技术。 如酶与基质、抑制剂、变构效应剂或辅酶；激素与细胞受体；维生素与结合蛋白；基团与核酸；抗体与抗原；外源凝集素与红细胞表面的抗原等都具有亲和力。 按照色谱的动力学过程分为 1、洗脱法   组分在固定相和流动性反复的进行分配和再分配，或吸附与解吸。由于各组分的分配系数不同或吸附系数不同而分离。 2、顶替法（置换法） 直接用流动性作为顶替剂，试样进入色谱柱后反复平衡。流动相在在固定相上的溶度或吸附力比试样强和试样中各组分的溶度与吸附力差异而分离。  前沿法    （迎头法） 用试样本身或溶解在溶剂中作为流动性。流动性通过色谱柱是按照组分在固定相上的溶度或吸附力差别顺序流出。最后流出的与通入试样的组分相同。只用于简单混合物的分离。 气相色谱（GC） 分离原理： 载气（如N2 ）通过进样器将样品带往色谱柱进行分离  ，空气和H2进入检测器燃烧升温。 色谱柱和检测器温度由控温仪控制。样品经检测后信号进入放大器放大，进入记录仪记录。 ?气相色谱法分类： 气—固 （GSC）只用于分离低分子物质 气—液（GLC） 气源：提供载气（N2）H2 、空气（燃烧） 气流进化及控制流量系统  死时间t M：不被吸附成分通过色谱住停留的时间； 保留时间t R 被吸附成分通过色谱住停留的时间； 调整保留时间t’ R = t R - t M由于吸附不被吸附成分多停的留时间 死体积VM = tM.F（流速×时间） 保留体积 VR=tR.F 调整保留体积VR’= t.’RF=VR-VM 相对保留值α = t’ R（2） / t’ R （1）  组分1对组分2相对保留值 分配系数K= Cs/Cm 被分离组分在固相和在流动相的浓度之比。 色谱区域宽度：组分在色谱柱中谱带扩张函数。 表示方法：标准偏差σ 标准偏差0.607倍峰高处峰宽的一半。 半峰宽度 Y1/2（半宽度、区域宽度）峰高一半处的宽度。 基线宽度 Y  色谱峰两侧拐点上的饿切线在基线上的截距。  Y= 4 σ ；  Y1/2 = 2.354σ  分配容量k=vl/vg        柱内液体所占体积/柱内气体所占体积。    组分分离效果受动力学与热力学因素影响。 动力学因素：气相扩散与固（液）相传质 热力学因素：相对保留值、反应在该温度下组分在两相分配过程与分配系数（与样品和固定相的结构性质有关）。 A、B两组分分离的必要条件： 1.两组分分配系数必须有差异。 2.区域扩展的速率小于区域分离速率。 3.保证快速分离的前提下提供足够长的色谱柱。 色谱定性、定量分析 定性分析 确定色谱图上每一个峰所代表的物质。在色谱条件一定时，任何一种物质都有确定的保留值。通过比较以知物与未知物的保留参数可以确定时什么物质。 定量分析           fih   fiA分别是峰高和面积校正因子。 对称的峰，用手工测量    AI =1.065 hI Y1/2  不对称的峰   AI =1/2hI （ Y0.15 +Y0.85）hI Y0.15 和Y0.85是峰高0.15和0.85出的宽度。  绝对校正因子与相对校正因子 绝对校正因子 指某组分I通过检测器的量与检测器对I组分响应信号之比： fiA = AI / mi； fih  = mi / hI 相对校正因子 指某组分I与基准组分s的绝对校正因子之比。 fisA = miAs / AI ms ； fish  = mi hs / ms hI 一般文献是指相对校正因子。 定量方法  外标法：         将欲测组分的标准物质配成系列浓度，进行色谱分析，以峰高或面积对浓度作图制作标准曲线，试样进行分析后，在曲线上查得峰面积或峰高后可以求得其百分含量。  内标法   当只须测定试样中某几个组分，或试样中所有组分不可能全部出峰时，用内标法。 准确称取样品，加入一定量某种物质作为内标，然后进行色谱分析。根据被测物质和内标在色谱图上相应峰面积（或峰高）和相对校正因子求出某组分的含量。 mi  /ms = AI fisA / As fssA ； mi   = AI fisA ms / As fssA mi % = （mi /m）×100% = （ AI fisAms  / As fssA）   归一法 归一是把式样中所有组分得含量之和按100%计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高为定量参数，通过下列公式计算各组分含量。 mi % = （AI fisA /∑fisA mi） ×100% 或 mi % = （hI fish /∑fish mi） ×100%   气相色谱仪结构 1.气路系统：载气/氢气、氮气、氦气和氩气。气路结构/减压阀、净化器、稳压阀、压力表、流量计。 2.进样系统：进样器、汽化室。 3.分离系统：色谱柱/填充柱；内径2—4mm，长度1—10m。柱形有U形和螺旋形。螺旋形直径与柱内径之比为15：1—25：1。 空心毛细管柱材质为玻璃或石英，内径一般为0.2—0.5mm，长度为30—300m，螺旋形。色谱柱分离效果与柱长、柱形、柱径、固定相和柱填料制备技术及操作条件有关。 气相色谱仪结构 4.温控系统：用来设定、控制和测量色谱柱炉温、汽化室、检测室得温度。 温度直接影响色谱柱的选择性、分离效果和检测器灵敏度及稳定性。 5.检测系统：检测器将载气中组分转变成易于测量的（电）信号。微分型检测器分为浓度型（热导池、电子捕获检测器器）和质量型（氢火焰离子化检测器）。 检测器性能指标 灵敏度：输入单位被检
第三章色谱技术.ppt