第二章色谱法原理（1） （Principles of hromatography ）2-1 概述色谱法早在1903 年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。后来不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。但不管属于哪一类色谱法，其共同的基本特点是具备两个相：不动的一相，称为固定相；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异。因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。色谱法分类1 ．按两相状态分类气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC ），根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GS C ）和气液色谱（GLC ）．液体为流动相的色谱称液相色谱（LC ）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱（LSC ）和液液色谱（LLC ）。超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC ）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相色谱又称化学键合相色谱（CBPC ）。2 ．按分离机理分类利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离3．按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。根据以上所述，将色谱法的分类总结于表2-l 中。2-2 色谱流出曲线及有关术语 一．流出曲线和色谱峰这种组分响应信号大小随时间变化所记录下来的曲线称为色谱流出曲线，也叫做色谱图。色谱图中曲线突起的部分称为色谱峰，由于响应信号的大小或强度与物质的量或物质的浓度成正比，所以，色谱流出曲线实际上是物质的量或浓度-- 时间曲线。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss 正态分布函数表示：式中：C—不同时间t时某物质的浓度，C0—进样浓度，tr—保留时间，σ—标准偏差。二、基线 是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图2－3中O—t 线．稳定的基线应该是一条水平直线。 三、峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图2－3中B′A 四、保留值 1．死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图2－3 中O′A′。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近．测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM 的比值计算。2 ．保留时间tR 试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图2－3 O′B ．它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。3 ．调整保留时间tR′ 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即  tR′= tR-tM  由于组份在色谱柱中的保留时间tR 包含了组份随流动相通过柱子所需要的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR 实际上是组份在固定相中停留的总时间．保留时间可用时间单位（如s）或距离单位（如cm ）表示。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定。4 ．死体积VM 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测池的空间的总和。当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相的流速F0 （ml ／min ）计算：VM = tM·F0 5．保留体积VR  指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间tR 的关系如下： VR = tR·F0 6 ．调整保留体积VR′某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即VR′= VR- VM 7 ．相对保留值γ2.1 某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值，是一个无量纲量。由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据。必须注意，相对保留值绝对不是两组份保留时间或保留体积之比。8、选择因子 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s）tR1′，然后再求其它峰（i）tR2′对这个峰的相对保留值。此时，可用符号α表示：式中　tR2′为后出峰的调整保留时间，所以这时α总是大于1。相对保留值常作为固定相选择性的参数，又叫选择因子，其值越大，选择性越好。五、区域宽度 色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素．度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：1. 标准偏差σ从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少个数。（2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析。(3) 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析。（4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相和流动相选择是否合适的依据。2—3 色谱法分析的基本原理色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。一、分配系数K和分配比k1 ．分配系数K 如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附/脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数。2. 分配比k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即k 值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。  k 值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。式中CS ，Cm 分别为组分在固定相和流动相中的浓度；Vm 为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs 为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs 表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。3 、滞留因子Rs 分配比k值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us ，由于固定相对组分有保留作用，所以us ＜u．此两速度之比称为滞留因子Rs 。Rs 若用质量分数表示，即 对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为整理式（2-14 ）～（2-17 ），可得3. 分配系数K与分配比k的关系其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其β值一般为6～35 ；对毛细管柱，其β值为60 ～600 。4 ．分配系数K及分配比k与选择因子α的关系根据式（2-9 ），（2-21 ）和（2-22 ），对A、B两组分的选择因子，用下式表示式（2-23 ）表明：通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K 或k值相等，则α=1 ，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。 二、塔板理论最早由Martin 等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。该理论假定：１、在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。３、所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。４、分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1 （例1mg 或1μg ）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1 ，即ns=nm 故nm=ns=0.5 。当一个板体积（lΔV ）的载气以脉动形式进入0 号板时，就将气相中含有nm 部分组分的载气顶到1号板上　此时0号板液相或固相中ns 部分组分及1号板气相中的nm 部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0.5 ，其中气液或气固两相各为0.25 而1号板上所含总量同样为：0.5 。气液或气固两相亦各为0.25 。　　　　以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。按上述分配过程，对于n=5 ，k=1 ，m=1 的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气液两相中的总质量）见表：2-2 由塔板理论可建流出曲线方程： m 为组分质量，Vr 为保留体积，V 为流动相的保留体积，n为理论塔板数。当V=Vr 时，C值最大，即：由流出曲线方程可推出：而理论塔板高度（H）即：从上两式可以看出，色谱峰W 越小，n 就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。通常填充色谱柱的n＞103 ，H＜1mm 。而毛细管柱n=105--106 ，H＜0.5mm 由于死时间tm 包括在tr 中,而实际的tm 不参与柱内分配,所计算的n值尽管很大,H 很小,但与实际柱效能相差甚远. 所以, 提出把tm 扣除,采用有效理论塔板数neff 和有效塔板高Heff 评价柱效能。塔板理论用热力