胚胎干细胞  与组织工程胚胎干细胞的定义1、全能干细胞2 、多能干细胞3 、专能干细胞一、胚胎干细胞研究进展（一）1981 年英国剑桥大学的Evans 和Kaufman 用延缓着床的胚泡的ICM （inner cells mass) 获得鼠的ES 细胞，同年美国的Maryin 用条件培养基获得鼠的ES 细胞。Roberston 用不同品系的鼠胚和具有不同遗传疾病的胚胎建立了细胞系并进行了多能性和嵌合特性的分析。现在已对猪牛羊等大动物的胚胎干细胞进行了一系列建系和分化研究。（二）国内的研究概况1 、1987 年上海细胞生物学研究所获得小鼠ES 细胞。2 、1996 年北京大学尚克刚建立了小鼠的ES 细胞系并对其特性进行了系列研究。3 、近几年赖良学、常万存、徐令、钱永胜、窦忠英等建立了兔、猪、牛等大动物的胚胎干细胞系或类胚胎干细胞系4 、山东农业大学生物工程实验室获得了鸡的胚胎干细胞并用其制备了嵌合体。（三）1995 年Thomson 从恒河猴的囊胚中分离克隆建立了第一个灵长类的细胞系。1998 年Thomson 利用自愿捐献的体外受精的胚胎免疫法除去透明带。在鼠胎儿成纤维细胞饲养层上获得了5个细胞系。连续培养5个月传到32 代仍可继续生长。同年Gearhart 和shamblott 利用流产胎儿的原始生殖细胞建立了人的胚胎干细胞系（EG ）随后澳大利亚、新加坡、以色列等国也获得了人的ES 细胞二、ES 细胞生物学特性（一）ES 细胞的一般特性1 、胚胎干细胞的基本特点---- 发育全能性能分化出属于三胚层的分化细胞。2 、可以在体外无限扩增。3 、具有种系传递功能。形成嵌合体的能力4 、在体外可以进行基因工程处理：如转基因，基因打靶，基因诱变(二）ES 细胞的形态1 、体外培养的ES 细胞无论有无饲养层的条件下培养，细胞都为圆形或卵圆形，呈集落生长时，细胞间紧密堆积，无明显的细胞界限，形似鸟巢。2 、细胞消化分散后的单个细胞体积小、亮、圆形、核大、胞浆少，一个或多个核仁（三）ES 细胞的核型（四）ES 细胞呈现高的端粒酶表达活性（五）人ES 细胞具有表达早期胚胎表面抗原（SSEA ，stage-specific embryonic antigen ）的特性（六）ES 细胞的体内分化1 、在免疫缺陷小鼠体内分化三胚层结构或畸胎瘤2 、将ES 细胞注入囊胚中可以形成形成嵌合体动物1984 年bradly 获得了注射ES 细胞的嵌合体鼠（七）ES 细胞的分化潜能在不同的饲养层和诱导条件下ES 细胞可以分化为以下六种细胞：1、造血细胞ES 细胞的拟胚体在体外可分化为卵黄囊血岛样结构分化产生红细胞、髓细胞和淋巴细胞。ES 细胞分化为造血细胞是可重复和高效的，除血清外不需其它因子，类似于胚胎发育过程。2、内皮细胞和血管3、心肌和肌细胞拟胚体在一定条件下培养数天可产生自动收缩的心肌细胞二甲基亚砜和肌肉专一性调节因子MyoD 转染ES 细胞结合可诱导ES 细胞分化为骨骼肌，并形成肌管。4、神经细胞维甲酸可提高贴壁培养的ES 细胞转化神经细胞，并表达特异蛋白-nestin, 并在实验中用来作供体移植入Huntingson’s 疾病模型大鼠体内，可治疗该种疾病。5 、脂肪细胞和软骨细胞ES 细胞在二甲基亚砜、胰岛素和三碘甲腺原酸的联合作用下可分化为脂肪细胞；的塞米松可诱导携带ROSA-geo 基因的ES 细胞转化为软骨细胞。三、ES 细胞的来源（一）哺乳动物动物胚胎干细胞1 、来源于ICM 2 、来源于生殖嵴的原始生殖细胞（二）人胚胎干细胞来源1 、利用人工授精遗留的胚胎或流产的胎儿。2 、将人的成熟的细胞核和移入人卵细胞培养至囊胚期分离ES 细胞3 、将人的细胞核移入其它动物卵细胞以获得ES 细胞4 、将人的细胞核移入ES 细胞内利用ES 细胞的胞浆诱导表达ES 特异基因四、ES 细胞的培养（一）ES 细胞培养的基本条件：（二）ES 细胞的培养（三）ES 细胞的鉴定1 、克隆及形态学观察2 、体外分化试验3 、体内分化和嵌合体制备五、ES 细胞的开发和利用（一）动物ES 开发和利用方向1 、用ES 细胞研究哺乳动物自身胚胎发育过程、时序调控和组织功能研究。2 、寻找调节胚胎细胞定向分化的关键因子诱导ES 细胞定向分化的条件。3 、制作转基因动物--- 生物反应器，或人体代用器官（二）人ES 细胞开发和利用方向1 、用人ES 细胞研究人类自身胚胎发育过程及组织功能研究2 、寻找调节胚胎细胞定向分化的关键因子诱导ES 细胞定向分化3 、利用胚胎干细胞成功地构建新药筛选模型。3、临床应用用ES 细胞作为组织移植的供体是具有诱惑力的设想，临床上首选的治疗目标是神经退行性病变、糖尿病、脊髓损伤及造血系统疾病。为了实现成功的移植，人们必须获得足够的干细胞，也就是治疗性克隆并且设法克服移植后的排斥反应，其可能的途径如下：（1）建立广泛的ES 细胞库，提供多个主要组织相容性抗原位点以供MHC 相配合；（2）建立普遍适用的供者细胞系在这些细胞系中对MHC 基因进行遗传学修饰；（3）用同源重组的方法将受体的MHC 基因转入ES 细胞；（4）直接把受体细胞的细胞核移入ES 细胞中，子代细胞将全部含有MHC 基因有关的伦理学问题1、人类胚胎是否享有“人”的权利将人胚胎干细胞应用于医学和生物学是否合法2 、如何对待克隆人的问题3 、潜在的危险病毒、致瘤性、免疫排斥组织工程人工脏器和脏器移植的难处1 、人工器官的机能缺陷2 、人工器官的相容性3 、人工器官的磨损4 、器官移植供体的缺乏一、组织工程的定义 	 组织工程最初是由Reddi 于1994 年提出的，是应用工程技术和生命科学的原理和方法来解释生理和病理状态下哺乳动物的组织结构与功能之间的关系，研究生物替代物，以恢复、维持或改进组织功能的一门新兴学科。组织工程包括三个组成部分：一、是提供细胞附着的细胞外间质；二、是提供细胞的应答信号；三、是触发组织形成的调节信号。组织工程的优点组织工程用少量组织细胞通过体外培养扩增，构建新的组织和器官，最终在人体实现无损伤修复和真正意义上的功能重建。这既不是“挖肉补疮”的修复，也不是移植式手术，而是利用人体自身细胞及组织工程的理论和方法，使原先缺损的组织和器官，沿着设计好的支架、模型，再顺其自然长出来。  　二、干细胞是解决难题的关键要让机体组织再生，就必须在构成机体组织的细胞增殖的同时，构筑细胞的支撑组织。通过对再生机体组织的研究发现，蝾螈和水螅的身体和人的骨骼及肝脏等，能以大致相同的构造实现再生。不管是前者还是后者，干细胞都在机体组织的再生中起到重要的作用。三、让机体激活的三件“工具”为了实现机体组织的再生，首先必须掌握“工具”。所谓“工具”指的是（1）细胞、（2）成为细胞立脚点的支持体和（3）让细胞增殖和分化的因子。1 、细胞：目前用于机体组织再生的细胞与其说是干细胞，不如说是由干细胞略微分化而成的前驱细胞和芽细胞（骨芽细胞等）。能够确保采用患者本身的细胞固然是好事，但是如果不能采用来自患者本身的细胞，就只能采用来自别人的细胞。在这种情况下，就得想办法克服机体的排异反应，比如考虑通过遗传基因重组去除细胞的抗原性。或者采取克隆技术。2、在构筑机体组织时，必须有成为组织的“构架”和“立脚点”的支持体。在组织工程中，由于把握来自机体本身的细胞外基体是很困难的事，只能代之以人工细胞外基体。作为人工细胞外基体使用的是立体的海绵状骨胶原。由于骨胶原在机体内能被分解，可以随着组织再生被机体全部吸收，人工细胞外基体也成为细胞增殖和分化的“立脚点”。此时，给已深入人工细胞外基体内部的细胞提供营养是十分重要的。3、要确保必要的细胞和“立脚点”，必须让细胞的数量大幅增加。控制细胞分裂的是“细胞增殖因子”。比如在骨骼组织中，细胞分化的阶段是：胚胎干细胞→骨系干细胞→骨前驱细胞→骨芽细胞→骨细胞（成熟细胞）。正是“细胞增殖因子”让细胞发生了分化。机体组织的再生在体内、体外都可以进行。在体内实施机体组织再生时，细胞、人工细胞外基体和细胞增殖和分化因子三者，并不是经常必不可少的。在体内实施机体组织，机体本身会提供必要的“工具”。不过与在体外工厂化大量生产皮肤相比，利用体内环境实现机体组织再生，要想大规模生产是很难的。原位皮肤干细胞技术已经应用于临床。四、正在实用化的尝试下面介绍几个在临床得到应用的机体组织再生的例子：1 、皮肤的再生。目前，无论在体外还是体上皮肤都能再生，在体外实行皮肤再生时使用的是骨胶原和广泛用于手术吸收性缝合线、以聚乙二醇为主要成分的立体多孔体，把皮肤细胞植于其上，这种人工培育的皮肤已实现工厂化生产。2 、关节软骨的再生，让采自患者自身的正常软骨细胞在体外增殖，将逐渐增殖的软骨细胞预先植入患者正常的细胞外基体，再移入病患部位，于是软骨组织便在人体内开始再生。3、类似腭骨这样的较大骨骼发生缺损，最常使用的是骨髓细胞。骨髓细胞中存在的骨系干细胞分化成骨芽细胞，生成构成骨骼成分的基磷和骨胶原，于是骨骼组织便实现了再生。为使再生骨骼组织恢复为原腭骨的同样形状，要用吸收性材料制成腭骨形状的“容器”，然后将骨髓细胞填进这个“容器”并植入口腔内。腭骨再生后，“容器”会逐渐在人体内被吸收并消失。4、末梢神经的再生，末梢神经纤维因外伤等原因被截断时，将两段神经纤维原样放置，让骨胶原纤维组织进入断面之间，断面便能结合。在这个过程中，把两段神经纤维用中空管连接，中枢神经产生的神经纤维会伸展至已死亡的神经末梢的断面。不过在现阶段，要让神经纤维延长到10 厘米长是不容易做到的，而且必须改善吸收性中空管的内部状况，增加中空管内的营养增殖因子和细胞连接因子。5、除了上述人机体组织的再生研究，目前人体小血管、中枢神经、大脑细胞、血液细胞、骨、关节、韧带、肌腱、半月板、心肌、心膜、心脏瓣膜、小肠、膀胱、食道、气管、乳房（脂肪组织）、硬膜、眼角膜、视网膜、毛发等组织的再生正在研究，其中若干种开始进入试验性的临床应用。6、利用细胞的生物人工脏器像肝脏和胰脏这样的由体内重要组织合成的脏器，仅用人工心脏和人工肾脏一类人工材料组成，在现代技术水平上几近不可能。科学家的思路是充分利用细胞，这就是混合型的人工脏器或被称为生物人工脏器的细胞材料复合体。生物人工脏器的代表作便是短时用于体外循环的生物人工肝脏和长期埋入人体的生物人工胰脏。在生物人工肝脏方面研究得最广泛的类型是将从猪体内分离出的肝细胞，植入中空管构成的组件内。生物人工胰脏是将在胰脏内分泌胰岛素的微小组织──胰岛包入免疫隔离膜内，免疫隔离膜不但可让毒素，也可让胰岛素和供给细胞的营养物质透过，但将患者血液中的免疫系统细胞和蛋白质阻挡在外。在欧洲和美国，生物人工肝脏和生物人工胰脏都已用于临床治疗。国内研究进展目前，曾经在裸鼠背上成功复制“人耳”的科学家曹谊林教授又有新突破，他已经在培养箱里培养出来了“体外再生耳朵”。现在研发中心已经开始着手人体细胞的培养，目前，中心已经在组织工程技术构建并修复关节软骨缺损、皮肤缺损、肌腱缺损、骨缺损等方面取得突破性进展，成果达到国际领先水平。军事医学科学院基础医学研究所的研究员王常勇、范明继成功在动物体内培育出关节软骨、气管软骨以及颅骨等简单组织之后在一只身长不足6厘米，体重不过30 克的裸鼠背上背着个制备出足有半个乒乓球大的狗膀胱作为一种新兴产业，组织工程具有良好的发展前景和广阔的应用市场，其商业利润非常诱人。所以一些研究机构与大公司联手进行开发研究，仅1997 年直接用于组织工程研发的费用就达5亿多美元，并以每年22% 的速度增长。相信随着干细胞体外分化技术和克隆技术的发展，组织工程即将或正在成为治疗组织、器官衰竭的有效疗法和辅助手段。 * * *