血小板的研究进展苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所阮长耿一、血小板黏附、活化在血栓形成中的重要性 在生理性止血及动脉血栓形成过程中，血小板粘附到暴露的血管内皮下基质并发生血小板活化是血栓形成的起始阶段，进而产生血小板聚集和释放反应，最终导致血小板血栓形成。现状：参与黏附的相关分子的结构、信号传导以及这些分子  缺陷所引起的临床疾病和症状；进展：vWF-A1/GPIb  , vWF-A2/ADAMTS13, vWF-A3- 胶原抗血栓药物：抗GPIb/IX/V －vWF －胶原轴；抗GPⅥ/α2β1 －胶原轴制剂；有关血小板胶原受体在血小板黏附及活化过程中的相对作用一直存在争议。最近发现GPIb/IX/V 与GPⅥ可发生免疫共沉淀，结合两者有相似的信号转导途径，故有人提出GPIb/IX/V 与GPⅥ在血小板膜上相互彼邻，在功能上相互协同。抗GPⅥ/α2β1 －胶原轴制剂 抗GPIa/IIa 抗体：15D7 和6F1 	 体外实验表面可抑制胶原诱导的血小板聚集；抑制高剪切力条件下血小板与固定的纤维状胶原表面的黏附抗GPⅥ单克隆抗体：JAQ1 9O12 、6B12 、11A12 、SZ118 等 体外实验中，JAQ1 完全抑制胶原诱导的血小板聚集，对凝血酶和佛波酯诱导的聚集无影响。 体内实验中，JAQ1 抑制胶原诱导的血小板聚集和促凝活性表达。	 肺栓塞模型中，95% 对照小鼠在栓塞诱发后5分钟内死亡，而经JAQ1 处理小鼠均存活。使用JAQ1 后出血的副作用轻。抗GPIb/IX/V －vWF －胶原轴抗GPIb 单克隆抗体: 6B4 (SZ2) 	 在狒狒的Folts 模型中，6B4 Fab 片断2 mg·kg －1注射。GPIb 封闭率69% ；股动脉CFR 抑制率100% ；瑞斯托霉素诱导的血小板聚集抑制率100% ；血小板数、出血时间无明显变化，PT 、APTT 正常。Folts 模型抗vWF A1 区单抗AJW200  在狗冠状动脉Folts’实验模型中，AJW200 0.3mg·kg －1，冠状动脉内血栓形成抑制率达96 ％，体外血小板聚集抑制率81% ；血小板数无明显变化，但出血时间有延长（5～22 分）。AJvW-2 抗血管内膜增殖效应活化血小板可释放出多种活性物质如PDGF 、PAF 、CD40L 、MIP-1α和P选择素等，介导血管损伤部为的炎性反应，出现炎性细胞迁移、平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖，促进动脉粥样斑块的发展。抗vWF A1 区单抗AJvW-2 可使受损的豚鼠颈动脉血管内膜/中层比下降65% ，对血小板数、出血时间、PT 、APTT 无影响。以上结果表明抑制血小板粘附可减少血小板活化及血小板来源的细胞因子释放，减轻炎性反应和细胞增殖，有助于延缓动脉内膜病变。抗vWF A1 区单抗AJW200 AJW200 人体实验（24 例），AJW200 0.05 mg·kg －1，血浆vWF 封闭率为62.4 ％；vWF ：Rcof 活性为34 ％±16 ％（对照116 ％±41 ％）；PFA-100 血流停止时间为202±78 秒（对照80±19 秒）；所有志愿者出血时间和vWF 抗原水平均无显著变化。抗GPIb/IX/V －vWF －胶原轴抗GPIb 单克隆抗体: 6B4 	 在狒狒的Folts 模型中，6B4 Fab 片断2 mg·kg －1注射。GPIb 封闭率69% ；股动脉CFR 抑制率100% ；瑞斯托霉素诱导的血小板聚集抑制率100% ；血小板数、出血时间无明显变化，PT 、APTT 正常。VWF A3 区单克隆抗体82D6A3 ：在狒狒动脉血栓形成实验中，82D6A3 0.3 mg·kg －1可完全抑制股动脉血管内血栓形成，vWF 与胶原结合能力抑制96 ％；实验动物的血小板数、凝血指标、VWF 水平和出血时间均无明显改变。抗血小板粘附药物的优点在动脉内高剪切力条件下，血小板有效粘附和血栓形成必需依赖胶原-vWF-GPIb 轴，对此途径的抑制可更为特异地防止动脉内的血栓形成，而对静脉系统的影响小，出血副作用轻。血小板粘附后的信号转导和血小板活化则主要依赖胶原-GPVI 轴，对此途径的抑制即可在更早阶段阻止血小板活化，进而抑制血栓形成。在较早阶段抑制了血小板与病变部位的粘附及血小板活化，可明显减少血小板释放CD40, PDGF 等细胞因子，能显著减轻血管炎性反应和细胞增殖，有助于延缓动脉内膜病变，减少再梗死的发生。vWF-cp 结构图及基因突变位点：临床表现：见于任何年龄，大多数在15—50 岁；女性多见。出血：以皮肤粘膜出血为主，严重者可发生颅内出血。微血管病性溶血性贫血：黄疸，血红蛋白尿。神经精神症状：意识紊乱、头痛、失语、惊厥、视力障碍、谵妄及偏瘫等；以一过性，反复性和多变性为特征。肾脏损害：蛋白尿、血尿、肌酐升高，肾功能衰竭。发热：热型不一，体温常达38℃～40.5℃。血常规、血管内溶血相关检查vWF 多聚体分析vWF-cp 活性测定vWF-cp 抗原测定vWF-cp 自身抗体测定vWF-cp 基因突变检查ADAMTS-13/FXI Complex ELISA  vWF-cp 活性测定 SDS-PAGE 加免疫印迹（Furlan 方法）双向免疫辐射计（Obert 方法）残余胶原结合试验（Gerristsen 方法）残余瑞斯脱霉素辅因子活性试验(Bohm 方法）特异性微小重组底物（GST-VWF73-H ）用于vWF-cp 活性检测治疗：诊断明确或高度怀疑本病时应尽早开始治疗。1 ，血浆置换及输注新鲜血浆仍是目前最有效方法，60 ％－90 ％病例有效，血浆置换量每天2－3升（20ml—30ml/Kg ），严重者可增加至40ml—80ml/Kg 。病情稳定后继续1－2周。2 ，免疫抑制剂长春新碱每周1－2mg×4 －6周；或泼尼松1mg/kg ，酌情增减。3 ，抗血小板GPIIb/IIIa 单抗可阻断血小板聚集，4 ，抗CD20 抗体、免疫球蛋白、切脾对难治、复发或存在自身抗体的TTP 有效。三、血小板血栓形成调控因素  黏附、活化后的血小板从血流中募集/聚集血小板，形成稳定的血小板血栓。除已知的调控因素外，目前发现有多种新的调控途径参与血小板血栓的稳定过程。Brass L. ATVB 2004;24:989-991 Gas6 的结构及作用Gas6 ( growth arrest-specific 6 ) 是一种维生素K依赖蛋白，结构类似蛋白S，分子量75kDa ，存在于静息血小板的α颗粒中。血小板活化后，Gas6 被释放至血小板表面和液相介质中。体内和体外实验均证明Gas6 具有促进血小板活化作用，Gas6 基因剔除或抗体抑制均可抑制血小板聚集及血栓形成。Gas6 受体为血小板膜表面蛋白Mer （Ax1,Tyro3) ，两者结合后，通过蛋白磷酸化途径（涉及PI-3K ）活化血小板。根据Gas6-Mer 作用特点，其功能发挥主要在血栓形成后期，对血栓形成有促进和稳定作用。Gas6 受体knockout 对血小板伸展功能的影响Gas6 受体knockout 对血栓形成功能的影响vWF 多聚体分析ADAMTS13 抗原测定（ELISA ）ADAMTS13 自身抗体测定（ELISA ）Gas6 受体knockout 对血小板聚集功能的影响* A1  A2 A3	 Exposed collagen platelet GPIb-IX-V  2 1 GPVI-Fc  血小板胶原受体 高剪切力条件下血小板初期不稳定粘附依赖GPIb/IX/V 复合物和GPⅥ的协同作用黏附后的血小板活化由GPⅥ介导血小板牢固粘附则依赖GPIa/IIa 和GPIIb/IIIa 的共同作用活化的血小板释放ADP 、TXA2 ，进一步加强血小板粘附和聚集 血小板的黏附过程Primary Platelet Adhesion Receptors GPVI 缺乏患者的血小板聚集和释放反应图Moroi M 等1989 年报导一名GPVI 缺乏患者有出血倾向，而胶原（2ug/ml) 诱导的血小板聚集为3% （正常对照：50-75% ）ATP 不释放。ADP 和瑞斯托霉素诱导的血小板聚集和释放正常。Moroi M, et al . J Clin Invest, 1989;84:1440 Aggregation of platelets from 2 deficient mice in response to soluble collagen. Integrin 2-deficient mice develop normally, are fertile, and display no obvious anatomical defects—Homozygous 2-deficient mice are viable and show no striking phenotypical differencewhen compared with their heterozygous and wild type littermates. Holtkotter O,et al.J Biol Chem, 2002:277:10789  各粘附分子缺乏患者出血程度GPVI GPIa-IIa GPIb-IX GPIIb-IIIa —±  ++ +++ 抗血小板药物药物作用环节第一代阿司匹林环氧酶抑制剂临床应用Ticlopidine  ADP 活化抑制剂临床应用第二代Reopro  GPIIb-IIIa 受体抑制剂临床应用第三代JAQ1 GPVI （胶原）受体抑制剂动物实验AjvW2, 6B4 “vWF-GPIb”抑制剂动物实验82D6A3 “vWF- 胶原”抑制剂动物实验6B4 AJvW2 血小板与胶原表面的有效黏附是血栓形成的必备条件之一，因而GPIb/IX/V-vWF- 胶原轴和GPⅥ/α2β1- 胶原轴为抗血小板粘附治疗的主要靶点。抗黏附治疗作用策略：15D7 11A12 SZ118 Reopro 对CFRs 发生的影响2.5ug/ml Reopro 0.0  3.0  6.0 0.0  2.5 813-F(ab)2 Reopro  0.0  3.0  6.0 0.0  2.5 813-F(ab)2 Reopro * * * * 0.01