2010-03 中国药典2010 版药品微生物检查指导原则我国微生物检查发展概况表防腐剂抗菌效力标准1 类供试品细菌7 天菌数下降不少于1.0 lg ，14 天菌数下降不少于3.0 lg ，第14 天到28 天菌数不增加。真菌与初始值比，到7、14 、28 天菌数均不增加。2 类供试品细菌14 天菌数下降不少于2.0 lg ，14 天到28 天菌数不增加。真菌与初始值比，到14 、28 天菌数均不增加。3 类供试品细菌14 天菌数下降不少于1.0 lg ，14 天到28 天菌数均不增加。真菌与初始值比，14 、28 天菌数均不增加。4 类供试品细菌，真菌与初始值比，14 、28 天菌数均不增长。注：1、表中“不增加”是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5 lg 。2 、0时菌数供试品加入试验菌，摇匀，立即取样检查，培养，计数，为0时，即初始值。替代方法的一般要求在以替代方法对样品检验的适用性进行验证前，必须证明所选用的替代方法具有方法适用性，即表明在不含样品的情况下，替代方法的专属性、精密度、检测限等参数。确认方法的适用性后，用样品按上表规定的参数进行验证。验证至少用2个批号的样品，每批样品每个菌应至少平行进行三次独立实验。参数验证的菌种应包括培养基适用性检查规定的菌种，必要时，还应根据替代方法及样品的特性增加相应的菌种。定性检验的方法验证微生物限度检查法应用指导原则药品微生物实验室规范指导原则2 、检测限：是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量，该数量是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。验证的关键是确定接种菌的最低数量（每单位不超过5cfu ），分别用药典方法和替代方法对该菌进行检验，比较两种方法的差异。与国外药典规定相同，要求试验菌的接种量应能够在采用药典方法检验时，有50 ％的检出率。检测限验证至少应重复进行5次。3 、重现性：是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。验证的关键是使接种菌的量在检测限以上，评价验证结果时，应排除样品均一性的影响4 、耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。对替代方法进行耐用性评价，确定方法操作的关键注意点。在开展了上述评价后，可以不必比较替代方法的耐用性与药典方法的差异。定量检验的方法验证1 、准确度：是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果的一致程度。准确度的确认应在检验的范围内。通常用微生物的回收率（％）来表示准确度。验证的菌浓度应该在检测范围内，一般应选择能够准确计数的最高浓度，系列稀释至较低浓度，并且至少应该有5种浓度，每种浓度重复检验5次。替代方法的回收率应该达到70 ％以上。当替代方法并不依赖微生物生长出菌落或出现混浊来进行定量时，可能出现回收率高于药典方法的情况，此时应结合专属性的内容对准确性进行评价。2 、精密度：是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度。通常采用标准偏差或相对标准偏差（变异系数）来表示。验证的菌浓度同准确度，每种浓度重复检验10 次。可以接受的相对标准偏差（RSD ）应不大于35 ％。一般来说，替代方法的相对标准偏差（RSD ）应不大于药典方法。在该项目上，USP 的规定是15 ％～35 ％，研究表明，当含菌浓度在30 ～300cfu/ml 时，计数结果的RSD 完全可能在15 ％以内，因此，指导原则中对该指标作了修改。3 、专属性：是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。验证的关键是合理评价样品的存在对检验结果的影响，当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时，这种评价显得尤为必要。4 、定量限：是指样品中能被准确检验的微生物最低数量。验证的关键是在检验范围的低限，选择尽可能低的5种菌浓度，每种浓度重复测定5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。5 、线性：是指在检验范围内，检验结果与样品中微生物数量成比例关系的程度。线性验证时必须覆盖能够准确检测的所有浓度范围。每株菌至少应该有5种浓度，每种浓度至少测定5次。在对验证数据进行处理时，应以样本中预期的菌浓度为自变量，以不同方法的计数结果为因变量，进行线性回归分析，计算相关系数，替代方法的相关系数不得低于0.95 。6 、范围：是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的高低限浓度或数量的区间。7 、重现性：是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度。反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。验证的关键是使接种菌的量在检测限以上，评价验证结果时应制备均一的实验样本8 、耐用性：是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。当检验方法采用基于培养的技术时，一般的参数变化是指对培养温度和时间进行调整，上述调整对检验结果的影响并不显著。此原则的制定是为了更好应用微生物限度检查法，对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步说明。应用此原则应结合2010 年版《中国药典》微生物限度检查法详细解读。主要对以下各条作了明确。对所用试剂的要求：有效性和无毒性。检验方法的选择：尽量选择操作简便，快速及避免损伤供试品中污染的微生物的方法。对离心沉淀法的重新认识：尽量避免采用该方法，更不宜采用高速离心沉淀集菌。对照培养基的说明：由中检所研制及分发。无法消除供试品的抑菌作用时，可根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则选择更高稀释级试验。6. 控制菌的进一步确认应选择已被认可的菌种鉴定方法。7. 药品的生产、贮存、销售及新药标准制定、进口药品标准复核、考察药品质量、仲裁中，除品种或制剂通则项下另有规定外，其微生物限度均以药典的“药品微生物限度标准”为依据。8. 2010 年版二部化学药制剂通则项下⑴有微生物限度要求的制剂，微生物限度为必检项目；⑵对于只有原则性要求的制剂（如：丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂），应对其被微生物污染的风险进行评估。在保证产品对患者安全的前提下，通过回顾性验证或在线验证积累的微生物污染数据表明每批均符合微生物限度标准的要求，那么可不进行批批检验，但必须保证每批最终产品均符合微生物限度规定。⑶上述固体制剂若因制剂本身及工艺的原因导致产品易受微生物污染，应在品种项下列出微生物限度检查项及微生物限度标准，如生化类制剂。9. 对局部给药制剂控制更严格。用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法要求。对于创伤程度无法判断的局部给药制剂，若没有证据证明药品不存在安全性风险则应符合无菌检查法要求。10. 制定药品的微生物限度标准时，除了依据“药品微生物限度标准”外，还应综合考虑原料来源、性质、生产工艺条件、给药途径及微生物污染对患者的潜在危险等因素，提出合理安全的微生物限度标准，因此，必要时，特殊品种为保证其疗效、稳定性及避免对使用者的潜在危害性，应制定更严格的微生物限度标准，并在品种项下规定，如眼用液体制剂，目前其生产工艺及生产条件尚难达到无菌产品的要求，但从使用者的安全性考虑，建议按无菌产品的要求进行控制。制定辅料、化学原料药、中药提取物的微生物限度标准时，除参照相应制剂的微生物限度标准外，还应综合考虑相应制剂及其生产工艺的特性。11. 2010 年版一部对动物类原药材粉作了明确规定，利于标准的正确理解和执行。具体规定如下：含动物类原药材粉的口服中药制剂要求不得检出沙门菌。其中的动物类原药材粉是指除蜂蜜、王浆、动物角、阿胶外的所有动物类原药材粉，如牡蛎、珍珠等贝类，海蜇、等水产品，冬虫夏草、人工牛黄等。药品微生物实验室规范指导原则用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。药品微生物的检验结果受到很多因素的影响，如实验人员在取样或试验过程中可能引入了污染微生物；微生物学分析方法本身的误差较大；样品中或环境中微生物可能分布不均匀等因素均影响药品微生物实验结果。因此，在药品检验中，为保证微生物试验数据的可靠性和重现性，药品微生物实验室必须使用经验证的检测方法并按良好的实验室规范指导试验。药品微生物实验室规范包括以下几个方面：人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设备、文件、实验记录、结果的判断等。一、人员从事药品微生物试验工作的人员均要受到教育、培训及具备相关工作的经验。 微生物实验人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。 实验室应依据实验人员的岗位及职责对其进行相应的培训，在确认他们可以承担某一试验前，他们不能独立从事该项微生物试验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别实验人员的继续教育计划。微生物实验室管理人员包括工作人员和监督人员，其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符。管理人员也应接受系统的教育和微生物实验室的培训如：管理技能、实验室安全、试验按排、预算、实验室研究、实验结果评估和数据偏差的调查及技术报告书写等。应熟练的应用SOP 有关内容到管理工作中；如制定不同工作岗位实验人员的培训课程和继续教育计划，随时掌握和了解试验人员的水平，根据每个人的技术水平分配适宜的工作岗位。对所有人员的培训、考核内容和结果均应记录。二、培养基培养基是绝大多数微生物试验的基础。因此，培养基的质量是微生物试验成功与否的关键因素。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。⑴培养基的制备：可按处方制备也可使用按处方生产的符合规定的商品化成品培养基，脱水培养基除附有处方和使用说明外还应注明有效期、贮存条件、适用性试验的质控菌株和用途。配制时应按使用说明上的要求操作，受潮结块不能