免疫学检测方法  免疫学检测方法主要包括酶联免疫吸附检测和放射免疫技术,该方面的研究取得了长足的发展。由于该方法操作简单，前处理简化，检测快速、准确、敏感，检验成本低，检测容量大，可同时进行大批量样品检测。因此．具有潜在的广泛应用价值。  免疫学检测技术是近几年发展起来的新技术，主要包括放射免疫技术、免疫酶技术、免疫荧光技术和免疫电镜技术等，现已广泛地应用于各个领域中。 10多年前，一些研究者开始尝试把放射免疫和免疫酶技术用于食品农药残留检测，并取得极大成功。  其中应用最多的是固相放射免疫饱和分析技术和酶联免疫吸附检测技术。 在这些检测技术中其核心反应都是抗原抗体反应。所谓抗原是指一切具有抗原性的物质： 抗体(又称免疫球蛋白)，是由抗原刺激机体而产生的特异性球蛋白。  作为抗原(完全抗原)需要包括两个方面的特性：免疫原性和反应原性。 免疫原性是指能够刺激机体产生抗体或诱导机体形成免疫回答反应的特性。 反应原性是指能够与其诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特性。完全抗原是一些大分子物质(分子量大于l万)，如蛋白质等。  如果一种抗原只有反应原性而没有免疫原性则称为不完全抗原(半抗原)，它通常是一些小分子物质(分子量小于1000)，必须与其它大分子物质结合后才具有免疫原性。各种农药属于这类物质，不具有免疫原性．因此农药残留的免疫学方法检测要较医学等领域中致病微生物等完全抗原的免疫学方法检测复杂得多。  农药残留酶联免疫，首先要把农药与载体蛋白连接起来，形成农药一载体蛋白结合物免疫原，才可用来免疫动物制备抗体。因此能否合成稳定、具有良好免疫原性的农药一载体蛋白结合物是整个农药残留免疫学检测技术研究的关键。  农药免疫学检测技术的原理  农药免疫学检测应用最多的两种固相免疫技术是固相放射免疫技术和酶联免疫吸附检测技术。  固相放射免疫技术是采用标记抗原与未知抗原竞争限定量的固相抗体结合位点，然后通过测定抗原一抗体结合物中放射性强度的改变，确定未知抗原的存在及含量。  酶联免疫（ ELISA） ELISA是通过在合适的载体上，酶标限定量抗原与未知抗原竞争固相抗体结合位点或固相抗原与未知抗原竞争限定量的标记抗体结合位点，形成抗体复合物。在一定底物参与下，复合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或还原成另一种带色物质。由于酶的降解底物与显色是成正比的，通过眼观或分光光度计测定，从而确定是否存在未知抗原或含量。   但由于放射免疫技术涉及放射材料的使用和经常制备放射标记物，检测设备也比较昂贵，所以越来越多地被较为安全、简便的ELISA方法取代。 在利用免疫技术进行农药定量检测时，需要制备标准曲线，之后根据制备好的标准曲线即可对农药残留进行定量。  免疫原的合成及酶标抗原的制备      由于农药属半抗原，不具有免疫原性，因此在制备抗体前首先要合成农药一载体蛋白结合物免疫酶原。由于各种农药分子结构不同．各研究者所采用的方法也不一样，但在绝大部分情况下由于农药分子不具备连接反应基团，农药分子首先要经过衍生，之后通过连接物与载体蛋白连接。 常用的裁体蛋白有牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清蛋白等。  农药衍生和连接的化学反应条件 不能导致半抗原分子结构发生明显改变，否则抗原性将发生变化。 另外，制备好的半抗原结合物在免疫动物前，要测定结合物中半抗原数目．因为结合中半抗原分子数目太多或太少，诱发抗体的能力都很差。 用于合成农药一载体蛋白结合物的方法，在不引起酶失活情况下通常都可用来连接酶与农药分子，制备酶标农药抗原。  抗农药抗体的制备      抗农药的多克隆抗体可用农药一载体蛋白结合物直接免疫兔子等动物．之后每间隔一个月加强免疫．一股6个月左右可获得满意效价的抗血清。如果结合物免疫原性较差，则需要甚至长达1年的免疫才能获得满意效价的抗血清。  多克隆抗体虽然具有生产成本低、生产方法简便等特点，但由于其特性随动物种类及个体差异而有变化，而且生产数量也受限制，因此不利于生产大批量商品试剂盒。 单克隆抗体可通过用毒素载体蛋白结合物免疫小白鼠等．之后建立杂交瘤细胞系来生产。单克隆抗体虽然生产成本高、技术复杂，但其特性稳定，交叉反应少，并可大批量生产，在生产商品试剂盒上很有价值。    ·  食品农药残留免疫学检测技术的应用   自从10多年前开始尝试把免疫学技术应用于食品农药残留检测以来，食品农药残留免疫学检测技术研究工作取得了极大的进展，已有大量检测农药(杀菌剂、除草剂、杀虫剂)的研究文献报道。  检测的食品范围很广．包括水果、蔬菜、饮料、啤酒、葡萄酒、鱼、肉、猪油、奶、植物油、蜂蜜、豆类、谷物及谷物加工产品等。  该方法不仅可用来定性筛选，而且也可以用来定量分析，其检测水平在很多农药可达到纳克(ng)甚至皮克(pg)水平。 另外一些检测的商品试剂盒也研制开发出来，并可用于食品中一些农药的残留检测。 在美国有关官方机构，如环境保护署(EFA)，农业部食品安全检验司(PSIS—USDA)和AOAC已制定厂农药残留免疫学检验商品试剂盒评定和认可的建议准则。  随着农药残留免疫学检测技术不断被完善和商品化(生产出试剂盒)，免疫学检测技术会成为食品农药残留和食品安全质量控制的有效快速的检测手段。 除草剂类农药残留免疫学检测技术研究的一些文献报道(国内尚未见有关的研究报道)，简述了方法类型、检出限、抗体类型、检测食品范围和检测农药种类等有关情况，另外还列出了一些已获得应用的商品试剂盒。  农药残留免疫学检测技术与传统的色谱、质谱法相比所需设备简单(如ELISA方法只需一台酶标仪)，或者不需检测设备．加样后直接进行眼观判定即可，适合于现场应用，前处理程序简化(不需净化)，检验快速，检测容量大．检验成本低。 液体食品．如牛奶、果汁、菜汁等通常不需要前处理．可直接取样检测。检验操作几十分钟至几个小时内即可完成，净化和浓缩可进一步提高检出限。  固体食品．如谷物等经抽提剂抽提、浓缩并重新溶于水溶液中即可取样检测，不需净化．检验操作(不包括前处理)可在几十分钟至几个小时内完成。 检测容量，试管法每次最多可同时分析十几个样品，如果使用磁珠技术每次可同时分折30—40个样品． 微量酶标板法(96孔)每次可同时分折44个样品．并且可同时做曲线。  尽管免疫学检测技术中农药与抗农药抗体反应是高度特异的，但由于该反应敏感性特别高，有时尽管底物的成分轻微干扰了农药与抗农药抗体的结合，这时如果参照用缓冲溶液来制备的标准曲线定量，会产生一个低的假阳性应答，从而干扰检测结果。这种情况可通过用不含农药的样品抽提物制备标准曲线来消除干扰，也可通过对样品抽提物进行高倍稀释来消除，但后者同时会降低检测敏感性。  免疫学检测系统中的抗农药抗体对于结构非相关的靶抗原〔农药〕表现极高的特异性，但某些与检测农药结构密切相关的农药，或待检农药的代谢产物可能与抗待捡农药抗体发生不同程度的交叉反应。如果样品中存在这些物质．该农药的定量检测就会降为半定量或定性捡测。但从另一个角度看，这种交又反应又是特别有用的．利用这种交叉反应．可用抗一种农药的抗体对包括母农药在内的结构密切相关的类似物及代谢产物进行多残留检测。   另外．有研究者认为．可以把抗几种结构相关或非相关的农药抗体混合．利用这种混合抗体进行几种农药多残留分析．对于检测大批量且农药污染又没有规律的样品，可以节省大量的时间和工作量。同时免疫
第六章免疫学检测方法.ppt