第七章  PCR技术  PCR技术  PCR的基本原理  PCR的类型  PCR技术的应用 DNA的复制 PCR的基本原理   PCR是由引物介导，聚合酶催化底物，在体外进行特异DNA扩增的一种方法。 全过程分为三步：           变性          退火          延伸 PCR的基本原理 PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点 可以是DNA，也可以是RNA 可以是粗制品 很强的耐热稳定性 最适温度为75～80 ℃ 无3’ 5’外切核酸酶活性，错配率为1／7500 发挥活性需要Mg2+ 具有反转录活性 100ul反应液中加入1～2.5uTaq聚合酶为宜 保存温度小于－20 ℃ Tris-HCl缓冲液（pH7.5），稳定pH值。 MgCl2(Mg2+) ：直接影响反应的特异性和产率。 PCR的基本原理 PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应体系 PCR过程 PCR的特点 PCR的类型 1、普通PCR：使用离体模板DNA 2、原位PCR：使用细胞或组织的DNA，             可定位 3、反转录PCR：从mRNA开始，以cDNA为模板              （RT-PCR）  PCR的类型 5、巢式PCR：多对引物介导，多次扩增 6、不对称PCR:两种引物使用不同的浓度 7、彩色PCR：将引物5’端用荧光物质标记 PCR的应用 1、基础研究 直接测序 构建cDNA文库 寻找新基因 标记DNA探针  PCR的应用 2、检测致病菌 3、疾病诊断 4、法医 5、植物遗传育种   * * Polymerase Chain Reaction  聚合酶链反应 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 解旋酶 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ GGAUCG 5‘ AUCGCG 5‘ 引物酶 引物酶 RNA引物 RNA引物 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 GGAUCG 5‘ AUCGCG 5‘ TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3’ ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3’ DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA的变性与复性 变性 加热 复性 退火 标准的PCR反应体系 4种dNTP混合物       各200umol/L 引物 　　　　 　    各10～100pmol 模板DNA 　　　      0.1～0.2ug Taq DNA聚合酶       2.5u 缓冲液 含Mg2+ 　　　 1.5mmol/L 底物 各种dNTP浓度应相同（20～200 umol/L） 浓度过低，反应速度较慢 浓度过高，影响特异性 引物设计的一般原则 1、引物长度以16～36b为好 2、碱基随机分布 3、引物自身不能含有互补序列 4、两个引物之间的互补或同源碱基小于4个 5、引物3’端不能错配 6、引物浓度在0.1～0.5 umol/L之间。 模板 Taq DNA聚合酶 缓冲液 DNA模板 DNA引物 dNTP TaqDNA聚合酶 缓冲液 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍          普通PCR反应的过程及条件： 变性         94 ℃     5min 变性         94 ℃     30s        复性         45～65 ℃ 30s       25～35个循环 延伸         72 ℃     45s～8min 最后一次延伸 72 ℃     7min 保存         4 ℃ ｝ 模板DNA 94℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 95℃ 50℃ 72℃ Taq Taq Taq Taq 72℃ 第2轮结束 重复30轮后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增  第4轮扩增 第5轮扩增 理想拷贝数=2n   n 循环次数     实际拷贝数=(1+x)n   X 平均效率,约为0.85   n 循环次数   电泳分析 特异性强  灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低  4、反向PCR：   扩增已知序列两端的未知序列   
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