薄层分析、酶抑制技术和荧光技术 薄层分析、酶抑制技术和荧光技术都是基于薄层展开后用不同的现色方法进行显色分析的技术。其中薄层的制备、展开和显色技术是该分析方法的基础。 薄层技术 薄层色谱法是把固定相（活性吸附剂或键合剂）均匀的铺在一块平整的板上，制成薄板。厚度约0.25mm。与纸上色谱法一样，点样经展开剂展开。 特点：操作简单、效果比纸上色谱法要好。 显色后斑点集中并且可以定量分析（与薄层扫描仪配套）。 试样量少，几微克到几百微克。 可以为高效液相色谱选择合适的固定相。  近代薄层色谱发展的类别简介 薄层板法（略） 圆筒色谱（管状色谱）法  将固定相涂渍在管的外壁上，可以减少横向扩散，宜于制备色谱用。 如果为小孔径管就为色谱棒。 锥形薄层色谱法  将薄层板制作成 倒圆锥体。展开时可以使溶剂前沿 扩大，展开剂向前沿扩散时形成速度梯度，结果抵消了谱带扩展，使试样再度浓缩。  径向薄层色谱法 两种类型：一种与圆形纸上色谱方法相似，分离效果可以提高1.5倍；另一种是将普通薄层板点样处固定相刮去，使展开剂只能通过点样处狭窄部分向前方弧形展开。 连续展开法 在密闭槽中进行上行展开， 展开剂移动一定距离后即终了。 顶板蒸发展开 用盖带有槽孔的展开槽，使部分薄层板露出槽外。展开时，槽里的展开剂不能蒸发，当上升到槽外时就蒸发。这种展开法能够缩短展开剂移动满的斑点之间的距离，不能够提高分离效能。  开口槽展开法 薄层板在没有上盖的展开槽中展开。展开过程中展开剂随时可以蒸发。越往上蒸发越快。当展开剂到达一定高度时，上行展开剂与蒸发展开剂速率相等，此时形成了负的速度梯度，提高了移动慢的组分的分离度，而降低了移动快的组分的分离度。  热板展开法 在薄层板的背面用热块加热。在高分离度区域加热，形成溶剂速度梯度和溶剂极性梯度，从而改善分离度并可使斑点高度浓缩，提高痕量组分的检测灵敏度。 连续展开是分离结构相似的多组分的有效方法。为了防止蒸发时色谱条件受槽外条件影响和展开剂污染空气，可以用在薄板顶端加吸附剂（多层滤纸）吸附展开剂的方法。  梯度展开法与双向展开法 梯度展开法 展开过程中不断按照一定比例改变展开剂中溶剂的组成。 这种方法有时能够提高分离效果，特别是反相薄层色谱中常用。 双向展开法 将试样点在薄层板的一角，先沿一个方向展开。取出薄层板，干燥后旋转90 o，然后再用同一种展开剂或换另一种展开剂沿另一方向展开。使前一次展开后的重叠斑点得以分离。  双向展开法特点 双向展开法还可以用以检测对光、热、酸、碱不稳定的组分。试样斑点经第一次展开后用光照或加热或用酸碱处理，旋转90 o，再用相同的展开剂在相同条件下展开，凡是在对角线上的斑点都是稳定的，凡是不在对角线上的点都是分解产物或反应产物。    多次展开法 试样经一次展开不能的到很好的分离结果时，是薄层板上的溶剂挥发后重新用展开剂展开。如此反复多次，直到有满意分离结果为止。 单向或双向多次展开 同一种展开剂单向或双向多次展开，反复展开时由于后沿比前沿移动快，可以使散开的斑点合拢，提高检测灵敏度。用两种或两种以上不同的展开剂分别进行多次展开，可以将不同的的组分分开，称为阶梯式展开或多极展开。   薄层色谱分析方法 薄层色谱主要用于定性分析，重要的指标是Rf i 。  Rf i=xi /Y    Xi：溶质i从点样点所行距离； Y：溶剂所行距离 Rf影响因素：溶剂极性，吸附剂活度，薄层厚度，层析缸中溶剂蒸汽饱和度，空气湿度。   固相选择：如前所述。 操作：制板、晾干、活化、点样、展开、显色 （计算Rf） 溶剂（展开剂）选择 溶剂（展开剂）选择：略。 一般情况下用用混合溶剂剂调节极性。 弱极性溶剂：石油醚、烃、卤烃 中等极性：乙醚、丙酮、醇， 强极性 ： 水，吡啶  酸 商品农药和已知种类的残留农药一般都选定了薄层条件。 25种常见有机磷农药展开系统       吸附剂/展开剂 1.硅胶/：甲苯 2.硅胶/乙酸乙酯与CH2Cl2(1:1) 3.硅胶/己烷－丙酮（4：1） 4.聚酰胺/己烷－丙酮（4：1） 5.聚酰胺/己烷－醋酸（19：1） 6.聚酰胺/甲醇－水（1：1） 7.聚酰胺/乙醇－水－氨水（4：4：2） 聚酰胺薄板制备与展开实例 1g吸附剂加入50mL带磨口塞的三角瓶中，再依次加入2mL甲醇、1mLCHCl3和2mL乙酸乙酯。每加一种溶剂充分振摇，使十分均匀。 取待涂片放在大玻璃片上，排一条。两边放等厚玻片下垫厚片（厚度与薄层同）将浆倒在装好的玻璃片上，用玻璃棒推均匀。通风干燥后可用。 展开注意事项（色谱过程） 点样后一定要使溶剂挥发至干；缸内蒸汽一定要饱和，二次展开一定要将薄板晾干后再展开。 薄层分析的显色的一般要求 显色要求 显色，少干扰或易排除 物质组成恒定，符合一定化学式，待测物含量与色斑大小、的深浅有定量灵敏度好高，检出限量足够小。 有色物要足够稳定 显色条件 显色尽可能完成，可以加入过量显色剂 酸度调节 适宜温度 显色时间要求短 几种显色记剂及显色方法 显色：不同显色剂有不同显色法   色谱分析关键措施之一是显色 显色剂       被显色物质      显   色  方   法            色  斑 AgNO3/NH3   有机Cl.Br  1.0ml1MagNO3+5mol/L                                            NH3－丙酮185ml。   灰或棕                                            日光或紫外光照5min PdCl2              含硫有机物   0.1gPdCl2+1MH2SO4                                        5ml.溶解后+100ml H2O.   黄色   I2                     多数农药        加热固体碘，使汽化                                       熏薄板5－10min。           黄色  荧光硅胶  有紫外吸收农药    GF254. HF254制版，                                              展开后挥发干溶剂，                                              紫外照射下观察      紫色斑 AgNO3显色方法应用实例 亦有涂板时将AgNO3深入吸附剂内。 方法1： 0.1 g AgNO3溶于20mL苯氧乙醇，加丙酮至200mL,加3%H2O2于暗处保存。喷到板上后紫外照10min。浅棕色背景上有紫斑。检出限量0.05ug－0.1ug。 方法2： 0.17g AgNO3+1mLH2O+5mL浓NH3·H2O 使用方法及色斑同上， 检出极限0.05ug—0.1ug  AgNO3显色方法与原理 方法3： 1g AgNO3+1mL水+95%乙醇至100mL，喷薄板。检出极限0.05ug。 显色原理：农药中的-x与Ag+在吸附表面，紫外照射下生成Ag3 Cl2·AgCl·nAg2Cl和AgClO,Ag ;Ag2O,AgCl 苯氧乙醇作用：加速AgNO3 与R-X的反应。 H2O2防背景过深，紫外加速AgCl分解，亦可加速农药分解，故可以先照
第五章薄层分析、酶抑制技术和荧光技术.ppt