免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术是将抗原－抗体反应的特异性与酶的高效，快速催化作用彼此结合，由此形成一种既具有免疫荧光、放射免疫的优点，又避免了他们的缺点。这项技术的原理和操作与荧光法有许多相似之处，所不同的是用酶来替代荧光素作为标志物，并采用底物被酶分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。目前可选用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP ）、碱性磷酸酶（AP ）、葡萄糖氧化酶（GOD ）、β－D半乳糖苷酶（β－D－Gal ）等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质相对较稳定且价格适中，广泛地被临床和实验室所应用多聚螯合物法(ELPS) 多聚螯合物法的特点多聚螯合物法应用了一种突破性的技术即多聚物技术，其在一条多聚肽链上螯合了相对应的第二抗和酶标志物。此法是近几年来发展较快的一种新的免疫组化技术，更由于酶连接方式较为直接，可进一步降低操作时一抗的工作液浓度，可使反应更灵敏、整个背景染色更低、染色时间短等特点。目前在临床上，特别是临床病理被广泛应用。该法也可分为一步法和二步法。一步法是将多聚物酶分子直接结合在特异性一抗上，而二步法是将多聚物酶分子连接在第二抗体上。免疫酶细胞化学技术1．标本选择的特点免疫酶标法可选择骨髓涂片或抽取一定量骨髓液用淋巴细胞分离液提取出单个核细胞。采用涂片机涂片，无论选用何种方法，均要求标本新鲜。虽然本法是抗原-抗体结合反应，但标本采集过久，会造成细胞表面抗原的丢失。特别是淋巴细胞相关抗原。通常标本采集一周后，其阳性率可明显下降。2 ．涂片的要求无论采用何种酶标记法，若用涂片法则需要将涂片完全干燥以后方能检测。若不干燥，在操作过程中易发生脱膜现象。虽然在前处理时有固定这一步，但为了使细胞表面的分化抗原少受因固定带来的损失，往往选择的固定剂和固定时间均不十分满意。若较薄的涂片标本干燥72 小时，可省略固定这一步，能提高部分细胞分化抗原的阳性表达。但必须控制好试验的渗透压，以免细胞破坏。3 ．标本的保管标本采集后至结果观察完毕以前，应尽可能避免接触与实验无关的化学物品。特别是苯、二甲苯、醚、乙醇、双氧水、醛等实验室常用试剂。因这些试剂具有强烈的凝固或氧化蛋白质的作用。使细胞表面的分化抗原减少，甚至失去，造成假阴性。4．试剂的准备各种试剂购进后，特别是单克隆抗体，除参考产品说明书，尚需结合各自的实验室条件，选定最佳稀释速，即调整一抗、二抗、三抗等之间的浓度，以求获得最佳特异性染色效果和最低的非特异性背景干扰。同时每次检测均需设置阳性细胞和阴性细胞的对照，以检查方法的可靠性。5 非特异性结合的防止抗体和组织成分的非特异性结合（Fc 受体），也可引起非特异性染色。另外，由于电荷性关系，抗体的阴电荷与组织中带阳电荷的蛋白质发生非特异性粘附，此时可加入与二抗同一种属源性的血清加以封闭。6 ．抗体孵育操作不当可造成的背景吸附及阳性细胞呈局限状产生，使结果产生假阳性和假阴性。所以在整个操作过程中均需在湿盒内进行，并注意加抗体时勿使涂片干枯以免造成抗体分布不均。7 ．结果观察结果观察要及时，酶标法虽然可保存较长时间不褪色，但不如新鲜时颜色鲜艳，易观察。如对结果有疑问，可重复操作，加以证实。8 ．阳性反应的了解在检测前应明确被检细胞的分化抗原所在的部位，即在细胞膜表面和细胞浆中及细胞核内，以利标本的前处理和阳性结果的准确判断，以免造成假阴性或阳性结果的误判、漏判。9 ．结果的比较结果观察的同时，必须对同一标本的普通染色片（瑞氏染色或H-E 染色）和细胞化学染色结果进行观察和比较，进一步确定具有临床意义的病理性细胞和其免疫标记的阳性情况，尽可能减少误诊和漏诊。10 ．阳性标准的确定结果判断由于受检测方法、试剂盒的特异性及敏感性，以及操作技术熟练程度等因素的影响，其结果判断的标准化问题尚难统一。但必须掌握阳性细胞定位明确，间质清晰，无背景染色，病理性细胞阳性表达在5% 以上，才可视为阳性。标本种类可选择：①新鲜血涂片或骨髓涂片。②体液标本可离心后取沉淀物涂片。③实体肿瘤标本可采用a 印片法、b 穿刺涂片法、c 匀浆法等。总之，一切有细胞的标本经过处理制成涂片后均可检测。特别适合对细胞的定性。划分前免疫细胞化学染色方法学的选择及评价免疫组化染色的方法较多，同时方法的选择，由于各种免疫组化技术各有特点，各有所长，所以不能一概而论地选择某一种方法好。对免疫组化技术的普及和长期开展较为重要。特别是一些基层医疗单位，若能根据各科室实际情况，依据标本的数量和病种，选用合适的免疫组化技术与单克隆抗体，将能进一步提高实际检测水平。如运用到各种急、慢性白血病的诊断中，结合细胞形态和细胞化学染色，那就是我们通常所讲的MIC 分型（即M- 形态学，I- 免疫学，C- 细胞学）。下面就几种常见方法加以评价。免疫酶细胞化学技术自1966 年免疫酶测定方法问世后,引起了人们极大的兴趣。由于不需特殊的荧光显微镜，即普通的光学显微镜就能观察，为免疫学的诊断提供了一条新的途径, 更因其操作方法简便，敏感性高，无须特殊仪器。所以很快广泛地被许多领域所应用，也非常适合基层医疗单位作为常规工作开展。目前常用的免疫酶细胞化技术主要为辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。他们既有直接法，也有间接法和生物亲和素-生物且都有商品试剂出售,其中辣根过氧化物酶（是免疫组化染色的首选酶指剂）。但作为血液学中的细胞免疫组化染色，若运用该酶指示剂就不太适应因为在血液和骨髓细胞中有一部分细胞含有非常丰富的内源性过氧化物酶，虽然在操作时可采取一些措施来抑制细胞内过氧化物酶，但这种处理比较粗糙，往往不能完全抑制该细胞内源酶的活性, 又可造成部分细胞表面抗原的破坏或丢失。而血液疾病特别是血液系统的许多恶性疾病的诊断中，通常是检测其细胞表面的分化抗原。再则在血液和骨髓组织中，还存在大量的成熟红细胞。其中的血红蛋白对本法也会产生强烈的干扰，因血红蛋白具过氧化物酶的功能，可对被检标本的背景产生难以去除的非特异性染色。以上二种因素可导致结果难以判断。考虑到上述因素，一般在对造血细胞检测时选用免疫碱性磷酸酶技术较合适。在血液细胞中，除成熟的中性粒细胞外，其他血细胞中几乎没有内源性碱性磷酸酶的存在，即使中性粒细胞内的碱性磷酸酶可采用降低反应的pH 值和少量左旋味唑，即可得到有效的抑制。在实际操作过程中，我们应充分考虑到被检组织或细胞抗原所存在的部位和强弱，来选择一种较理想和较稳定的方法，就免疫碱性磷酸酶技术中，最常用的是APAAP 、ELPS 法，前者特异性非常好，可敏感性略低，完全能符合血细胞表面分化抗原检测的试剂，价格略高。后者敏感性很高，对细胞表面或胞浆内很弱的抗原讯号，能有效地被扩大，特别适宜造血系统的恶性疾病诊断，而且特异性也非常好。试剂价格较低，比较适合各基层单位的开展和应用。免疫标记的选择与应用T 细胞标记T 细胞及其亚群: T 祖细胞（pro-T ）的表型为CD34+ 、TdT+ 、CD10+ 、CD7+ 未成熟T细胞标志CD3 、CD4 和CD8 。在T细胞发育过程中，CD7 是最早出现的T细胞标志，且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞表面标志需经历一定的变化过程。从CD7+ 、CD2- 、CD3- 、CD4- 、CD8- 、→CD7+ 、CD2+ 、CD3+ 、CD4- 、CD8- 、（即CD4 、CD8 双阴性）→CD7+ 、CD1+ 、CD2+ 、CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 、（即CD4 、CD8 双阳性），最后发育成CD7+ 、CD2+ 、CD3+ 、CD4+ 、CD8- 、和CD7+ 、CD2+ 、CD3+ 、CD4- 、CD8+ 、TCR+ 单阳性的两群成熟胸腺细胞，然后进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能。但在正常外周血中通常存在CD3+ 、CD4+ 、CD8- （TH/TI ），CD3+ 、CD4- 、CD8+ （TS/TC ），CD3+ CD4+ CD8+ 和CD3+ CD4- CD8- 四种表型不同的T细胞，它们分别占T细胞总数的60%~70% ，20%~30% ，1%~3% ，1%~10% 。前三种表型细胞的TCR 主要为TCRαβ，而CD4- CD8- T 细胞主要表达TCRγδ，他们都执行细胞免疫功能。CD2 是绵羊红细胞受体和淋巴细胞功能相关抗原-2 （LFA-2 ），表达于人95%T 细胞、50% ～70 ％胸腺细胞和大颗粒淋巴细胞（LGL ／NK ）的表面。CD3 是T细胞表面抗原，表达于成熟胸腺细胞、静息和激活的外周血T细胞，是鉴定T细胞的重要标志，其胞浆和膜CD3 是早期和普通型T细胞白血病的主要分型标记。CD5 、CD7 是T细胞白血病较特异的标记，也是髓系白血病时最常见的伴随标记。CD15 、CD45 则是白细胞的共同标记抗体，在淋巴瘤的诊断中有一定的价值。而CD25 和CD28 主要分布于活化T淋巴细胞表面，为活化T淋巴细胞标志。胸腺细胞、静止T细胞、静止B细胞以及NK 细胞表面无表达。主要用于淋巴细胞疾病的免疫分型。外周血淋巴细胞CD25+ 、CD28+ 占54% ～86% B细胞标记B 细胞B 细胞的分化主要分为B祖细胞、前B 细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞6个阶段。（1）B祖细胞（pro-B ）：此期最早识别的B细胞特异性抗原是CD19 ，同时表达CD34 、细胞核TdT 、HLA-DR 、CD40 、CyCD22 。（2）前B细胞（pre-B ）：CD34 和TdT 消失，出现CyCD79 、CD10 、CD20 、CD9 、CDw78 、CD74 ，cμ+ （胞浆IgM 重链）。（3）未成熟（早期）B细胞（immature B cell ）：CD9 、CD10 消失，出现SIgM 、CD22 。CD20 、CD24 、CD40 、CD72 、CD74 、CDw78 、CD79 表达增加。其他新的B抗原CD37 、CD2 、CDw75 、CDw76 相继出现。（4）成熟B细胞（mature B cell ）：SIgM 和IgD 同时表达，并出现CR 、FcR 和丝裂原受体，上述B细胞抗原继续存在。（5）活化B细胞（activated B cell ）：成熟B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞，继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激活抗原CD23 、CD77 、CD80 、CD86 和其他激活相关抗原如CD25 、CD26 、CD30 、CD69 、CD70 、CD71 、CD38 等。膜结合型Ig 逐渐减少，分泌型Ig 逐渐增加，并可发现Ig 基因重链类型转换。（6）浆细胞（plasma cell ）：激活B细胞进一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得PC-1 、PCA-1 和CD138 浆细胞特异抗原，CD85 表达增加，CD38 抗原再出现。而SIg 和上述B抗原消失。CD79 仍可存在于胞质中。B细胞上的CD 抗原分为：①B 细胞限制性（特异性）抗原：CD19 、CD20 、CD21 、