(1)金属离子浓度:浓度越低,pH值就越高; c. 影响金属氢氧化物沉淀pH值的因素 (2)离子的本性:阳离子电荷越多,半径越小则极化作用越强,沉淀所需pH值较低; (3)同一周期,自左向右,阳离子电荷增加,极化作用增强,与OH-结合逐渐牢固,则阳离子沉淀时的pH值就逐渐降低。 例如:Mg2+沉淀时的pH值为10.5,而Al3+则pH=4.2 (4)不同价态金属离子生成氢氧化物或水合氧化物不同。 无机共沉淀剂 1、吸附共沉淀剂 吸附是在沉淀表面吸附和沉淀有共同离子的盐。 Fe(OH)3:金属Cu中分离微量的Al PbS: 富集微量的Cu2+ 2、混晶共沉淀剂 两种化合物的晶型相同,离子半径相差在10%-15%以内产生混晶。 钢中的铍,可以利用BaSO4形成混晶富集。 SrSO4生成混晶以富集食物中的痕量Pb2+,Fe3+、Cd2+、Co2+等离子不干扰。(选择性好) 3、形成晶核的共沉淀剂(极微量离子) 4、沉淀的转化作用(溶液中微量的Cu2+,CdS滤纸) 蛋白质分子的表面特性 蛋白质是两性高分子电解质,由疏水性不同的20多种氨基酸组成。在水溶液中,多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势,使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。但是,仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面,形成硫水区。因此,蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和硫水区构成。 产生“盐析” (Salting out) 的原因 盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离子基团结合,形成离子对,使其分子之间电排斥作用减弱而相互聚集,靠拢。 中性盐的亲水性比蛋白质大,盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去水化膜,暴露出疏水区,由于疏水区的相互作用,使其沉淀。 纯一单蛋白质有公式:lg S = β-kS×I S 为蛋白质溶解度(g/L); β 为I=0时lg S,它取决于溶质的性质; kS 为盐析常数,主要决定于加入盐的性 质及Pr性质。 I 为盐离子强度(mol/L) 盐析的讨论 ㈠. 单一纯蛋白质的盐析 1. 在一定的pH和温度下,改变离子强度- kS盐析法 盐、Pr一定, kS值一定,I↑则 S↓ 2.在一定的离子强度下,改变pH和温度- β盐析法 β—pH:在Pr 的pI时其溶解度较小 β—温度:在保证Pr不变性下,温度↑ β↓ 利于盐析。 3.原始浓度P P小盐析所需I高,P大盐析所需I低 对混合Pr的盐析,P大,会发生严重共沉作 用,一般控制浓度为 2.5-3%。 ㈡. 混合Pr的盐析 1.合适盐析范围的选择:不同Pr盐析峰有重叠,须权衡纯度回收率。 2.改变原始浓度: 一种蛋白质的不同浓度的沉淀曲线会变化。 3.二次盐析:在原盐浓度下二次盐析,可除去易溶杂质,但不能除去难溶杂质。 盐析操作要点 1.盐的种类及选择 可使用的中性盐有:(NH4)2SO4、 Na2SO4、 MgSO4、 NaCl NaAc、 Na3PO4 柠檬酸钠和 硫氰化钾等, (NH4)2SO4、 Na2SO4最广泛,前者最受欢迎 2.盐析范围的确定 可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。(从回收率和纯度考虑) 3.盐的加入方式 固体 缓慢加,防泡沫,要平衡。 液体(饱和盐溶液)要求盐析范围小于50%饱和度取一份小样分段盐析,从回收率和纯度考虑来确定范围 4. Pr的原始浓度 太稀的蛋白质溶液,不仅消耗大量中性盐,对Pr回收也有影响;高浓度可节约盐用量,但须适中,以避免共沉。 盐析操作的其他方法 1.透析盐析 将Pr溶液盛于透析袋中,放入一定浓度的盐溶液中,由于渗透压的作用,袋中盐浓度连续性变化,使Pr↓ 2.反抽提法(Back-Extraction) 将包括要分离的Pr在内的多种Pr一起沉淀出来,然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物。 影响盐析的因素 1. 溶质(蛋白质等)种类 不同溶质的kS和β均不相同,所需的离子强度也不同。 2. 溶质(蛋白质等)浓度 蛋白质浓度大时,中性盐的极限沉淀浓度低,共沉作用强,分辨率低,但用盐量少,蛋白质溶解损失小; 蛋白质浓度较小时,情况相反。一般蛋白质浓度控制在2-3%为宜 3. pH 等电点附近,用盐量少,蛋白质收率高。 4. 温度 温度升高,溶解度升高;多数蛋白质在高盐浓度下,其溶解度反而下降,胃蛋白酶,大豆球蛋白例外。 影响沉淀类型和性状的因素 定向速率:沉淀物质本性决定 聚集速率:决定于沉淀的相对过饱和度 Q: 加入沉淀剂瞬间生成沉淀的浓度 S: 沉淀的溶解度 K: 比例常数 实现均相沉淀的手段 (1) 在溶液中加入能产生沉淀剂的化学试剂, 使得通过化学反应均匀产生出沉淀剂。 (2) 利用某种试剂的水解反应使溶液的pH值发生变化, 使pH 值达到一定值时就会生成沉淀。 (3) 将溶液与沉淀剂在某种能与水混溶的溶剂中混合, 再缓慢蒸去溶剂, 使之在缓冲条件下实现均相沉淀。 (4) 破坏可溶性络合物。 1. 在固定蛋白质溶液的 pH 值与温度的前提下, 添加盐来调节溶液离子强度以达到沉淀蛋白质的目的。此法常用于蛋白质粗制品的分级沉淀和酶制剂的制备等。 2. 在一定的离子强度下, 调节溶液的pH值或温度以达到沉淀蛋白质的目的, 此法适用于蛋白质的提纯精制以及饱和结晶等。 影响盐析效果的因素有蛋白质的浓度、盐类、离子类型、离子浓度、pH 值、温度等. 蛋白质类化合物的盐析沉淀手段通常有两种 : 盐析沉淀条件中 , 中性盐的合理选择至关重要 , 根据离子促变序列, 多价盐类的盐析效果比单价的效果好, 阴离子的效果比阳离子的好。顺序大致如下 : 柠檬酸根 酒石酸根 PO43- F- I03- SO42- 醋酸根 B2O3- Cl- Cl03- Br- N03- ClO4- I- SCN-;Th4+ A13+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ ;Mg2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+。 在蛋白质溶液中 , 一般以硫酸铵、硫酸钠应用最广 , 选择中性 盐时注意添加盐的纯度 , 避免杂质带来干扰或对蛋白质的毒害。使 用带金属离子的盐类时 , 可考虑添加一定量的金属整合剂如 EDTA 等。 蛋白质或酶等物质经盐析沉淀分离后 , 产品夹带盐分, 需脱盐处理。常用的脱盐处理方法有透析法、超滤法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法等。 添加某种化合物与溶液中的待分离物质生成难溶性的复合物,从而从溶液中沉淀析出的方法 , 称为沉淀剂沉淀。添加的化合物称为沉淀剂。沉淀剂沉淀分离主要有金属离子沉淀法,酸类及阴离子沉淀法,非离子型聚合物沉淀法以及均相
第2章 沉淀分离法.ppt
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