（1）金属离子浓度：浓度越低，pH值就越高；       c. 影响金属氢氧化物沉淀pH值的因素 （2）离子的本性：阳离子电荷越多，半径越小则极化作用越强，沉淀所需pH值较低； （3）同一周期，自左向右，阳离子电荷增加，极化作用增强，与OH-结合逐渐牢固，则阳离子沉淀时的pH值就逐渐降低。 例如：Mg2+沉淀时的pH值为10.5，而Al3+则pH=4.2 （4）不同价态金属离子生成氢氧化物或水合氧化物不同。    无机共沉淀剂 1、吸附共沉淀剂      吸附是在沉淀表面吸附和沉淀有共同离子的盐。         Fe(OH)3:金属Cu中分离微量的Al         PbS: 富集微量的Cu2+ 2、混晶共沉淀剂      两种化合物的晶型相同，离子半径相差在10%-15%以内产生混晶。      钢中的铍，可以利用BaSO4形成混晶富集。      SrSO4生成混晶以富集食物中的痕量Pb2+，Fe3+、Cd2+、Co2+等离子不干扰。（选择性好） 3、形成晶核的共沉淀剂（极微量离子） 4、沉淀的转化作用（溶液中微量的Cu2+，CdS滤纸)             蛋白质分子的表面特性      蛋白质是两性高分子电解质，由疏水性不同的20多种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。但是，仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成硫水区。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和硫水区构成。  产生“盐析” （Salting out） 的原因 盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离子基团结合，形成离子对，使其分子之间电排斥作用减弱而相互聚集，靠拢。  中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区，由于疏水区的相互作用，使其沉淀。 纯一单蛋白质有公式：lg S = β－kS×I       S　为蛋白质溶解度（g/L）；      β　为I=0时lg S，它取决于溶质的性质； 　  kS　为盐析常数，主要决定于加入盐的性　 　　　质及Pr性质。      I　为盐离子强度（mol/L）  盐析的讨论 ㈠. 单一纯蛋白质的盐析      1． 在一定的pH和温度下，改变离子强度－ 　　　 kS盐析法      　　盐、Pr一定， kS值一定，I↑则 S↓      2．在一定的离子强度下，改变pH和温度－ 　　　β盐析法           β—pH：在Pr 的pI时其溶解度较小           β—温度：在保证Pr不变性下，温度↑ 　　　　β↓ 利于盐析。      3．原始浓度P            P小盐析所需I高，P大盐析所需I低          　 对混合Pr的盐析，P大，会发生严重共沉作 　　　　用，一般控制浓度为 2.5-3%。  ㈡.  混合Pr的盐析 1．合适盐析范围的选择：不同Pr盐析峰有重叠，须权衡纯度回收率。 2．改变原始浓度： 一种蛋白质的不同浓度的沉淀曲线会变化。 3．二次盐析：在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不能除去难溶杂质。   盐析操作要点 1．盐的种类及选择            可使用的中性盐有：(NH4)2SO4、 Na2SO4、 MgSO4、 NaCl  NaAc、 Na3PO4 柠檬酸钠和 硫氰化钾等， (NH4)2SO4、 Na2SO4最广泛，前者最受欢迎 2．盐析范围的确定           可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。（从回收率和纯度考虑）    3．盐的加入方式     固体 缓慢加，防泡沫，要平衡。     液体（饱和盐溶液）要求盐析范围小于50%饱和度取一份小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围 4. Pr的原始浓度          太稀的蛋白质溶液，不仅消耗大量中性盐，对Pr回收也有影响；高浓度可节约盐用量，但须适中，以避免共沉。  盐析操作的其他方法 1．透析盐析     将Pr溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使Pr↓           2．反抽提法（Back-Extraction）     将包括要分离的Pr在内的多种Pr一起沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物。        影响盐析的因素 1. 溶质（蛋白质等）种类     不同溶质的kS和β均不相同，所需的离子强度也不同。 2. 溶质（蛋白质等）浓度      蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量少，蛋白质溶解损失小；      蛋白质浓度较小时，情况相反。一般蛋白质浓度控制在2-3％为宜 3.  pH     等电点附近，用盐量少，蛋白质收率高。 4.  温度     温度升高，溶解度升高；多数蛋白质在高盐浓度下，其溶解度反而下降，胃蛋白酶，大豆球蛋白例外。  影响沉淀类型和性状的因素 定向速率：沉淀物质本性决定 聚集速率：决定于沉淀的相对过饱和度    Q: 加入沉淀剂瞬间生成沉淀的浓度 S: 沉淀的溶解度 K： 比例常数  实现均相沉淀的手段 (1) 在溶液中加入能产生沉淀剂的化学试剂, 使得通过化学反应均匀产生出沉淀剂。 (2) 利用某种试剂的水解反应使溶液的pH值发生变化, 使pH 值达到一定值时就会生成沉淀。 (3) 将溶液与沉淀剂在某种能与水混溶的溶剂中混合, 再缓慢蒸去溶剂, 使之在缓冲条件下实现均相沉淀。 (4) 破坏可溶性络合物。  1. 在固定蛋白质溶液的 pH 值与温度的前提下, 添加盐来调节溶液离子强度以达到沉淀蛋白质的目的。此法常用于蛋白质粗制品的分级沉淀和酶制剂的制备等。    2. 在一定的离子强度下, 调节溶液的pH值或温度以达到沉淀蛋白质的目的, 此法适用于蛋白质的提纯精制以及饱和结晶等。       影响盐析效果的因素有蛋白质的浓度、盐类、离子类型、离子浓度、pH 值、温度等. 蛋白质类化合物的盐析沉淀手段通常有两种 :       盐析沉淀条件中 , 中性盐的合理选择至关重要 , 根据离子促变序列, 多价盐类的盐析效果比单价的效果好, 阴离子的效果比阳离子的好。顺序大致如下 : 柠檬酸根   酒石酸根   PO43-   F-   I03-   SO42-   醋酸根   B2O3-   Cl-   Cl03-   Br-   N03-   ClO4-   I-   SCN-；Th4+   A13+   H+   Ba2+   Sr2+   Ca2+ ；Mg2+   Cs+   Rb+   NH4+    K+   Na+   Li+。     在蛋白质溶液中 , 一般以硫酸铵、硫酸钠应用最广 , 选择中性 盐时注意添加盐的纯度 , 避免杂质带来干扰或对蛋白质的毒害。使 用带金属离子的盐类时 , 可考虑添加一定量的金属整合剂如 EDTA 等。     蛋白质或酶等物质经盐析沉淀分离后 , 产品夹带盐分, 需脱盐处理。常用的脱盐处理方法有透析法、超滤法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法等。 	   添加某种化合物与溶液中的待分离物质生成难溶性的复合物，从而从溶液中沉淀析出的方法 , 称为沉淀剂沉淀。添加的化合物称为沉淀剂。沉淀剂沉淀分离主要有金属离子沉淀法,酸类及阴离子沉淀法,非离子型聚合物沉淀法以及均相
第2章 沉淀分离法.ppt