微生物的基本知识回顾细菌的性质1 菌体形态:球，杆，螺旋约40 层网状肽聚糖覆盖在细胞表面，磷壁酸贯穿于肽聚糖层，形成厚约20~80nm 的细胞壁；磷壁酸贯穿其中；内壁层：靠近细胞膜，为1~2 层网状肽聚糖；外壁层：脂多糖（LPS ）、磷脂层和脂蛋白层；细菌的特出结构芽孢：在其生长的一定阶段在细胞内形成圆形或椭圆形、圆柱形休眠体结构称为芽孢。功能：对恶劣环境有很强的抵抗能力，有的芽孢，在一定条件下可保持活力数年甚至数十年之久，它本身具有一个细胞维持生命的所有功能。特点：耐高温，抗热性很强；抗化学药物和酸类；对溶菌酶有抗性。细菌的特出物质热原质：特点：耐高温；不具挥发性（重要疏水原理）；易被强酸、强碱破坏；可滤过性；易吸附性；可稀释性（水溶性）内毒素：细胞壁外层，属于细胞壁的组成部分（脂质A）一般与细胞结合在一起不分泌到环境中，只有当细菌溶解（裂解）后才释放出来，故称内毒素。少量内毒素0.001μg 入血即可引起发热反应。内毒素被吞噬细胞吞饮后，细胞释放出内源性致热原，经血流到达下丘脑，体温调节中枢引起发热。作用特点：没有组织器官的选择性肌体发热，腹泻，出血性休克或其他组织损伤不能经甲醛脱毒3 细菌纯培养的群体生长规律细菌菌落放线菌菌落霉菌菌落2010 年版中国药典微生物检验主要增修订内容1. 培养基的质量控制2. 菌种的质量控制1. 微生物检验培养基质量控制技术1.1 培养基制备过程中的注意事项www.book118.com 培养基的水化培养基水化时不得用铜锅或铁锅,以防有离子混入培养基中,影响微生物的生长；配制培养基最常用的溶剂是纯化水, 不能含有任何可能抑制或影响微生物生长的物质；培养基制备过程中的注意事项www.book118.com 培养基的溶解在培养基分装灭菌前,各成分应溶解均匀, 使用电炉等设备煮沸培养基时,应用小火加热,并边加热边搅拌,避免培养基焦化或爆沸溢出。培养基制备过程中的注意事项www.book118.com 培养基的灭菌已配制好的培养基必须立即灭菌湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间培养基制备过程中的注意事项www.book118.com 培养基的pH 微生物必须在适宜的pH 范围内才能正常生长繁殖或体现其生物特性。调整培养基的pH, 应用1 mol/LNaOH 或1 mol/L HCl 调整pH ，一般灭菌前比最终pH 高0.2 ～0.3 。培养基制备过程中的注意事项www.book118.com 培养基的保温灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度,避免长时间保存在灭菌锅内,造成过度灭菌,影响培养基的营养成分或选择性效果。1.2 培养基质量控制（2010 版药典）培养基适用性检查二、定量质控菌株（BioBall ）BioBall 是由生物梅里埃BTF 公司生产的定量质控标准菌株，其水溶性球状物包含了数量精确的微生物个体，主要用于培养基生长能力验证、无菌控制、微生物限度检查、抑菌效力检查、阳性对照、方法验证、能力验证和MOU 测定等试验，广泛用于制药工业、食品工业、水及废水检测和其他相关行业的微生物质控。目前，BioBall 有超过25 种常用的检测标准菌种，可提供SingleShot 、MultiShot-550 、HighDose -10K 和MultiShot-10E8 四类系列产品，分别含有28~30cfu （标准误差小于或等于3cfu ）、500~600cfu 、8000~12000 cfu 和0.7~1.5x 108 cfu 数量的孢子、芽孢或细胞。菌落计数法证明培养基生长能力USP USP 要求每批配制培养基作促生长能力测试菌种选择（变化大）：每个微生物单独测试大豆酪蛋白消化培养基：金葡，铜绿，枯草沙堡葡萄糖培养基：白念，黑曲方法：在培养中加入少量中（不超过100cfu ）的微生物，按要求培养。对于新鲜制备的菌液，生长与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致。标准：计数结果与标准接种物的计算量差别小于系数2（即计数结果在标准接种物数量的50%-200% ）。USP 控制菌检查用固体培养基能力检查：使用表面涂布法，在培养中加入少量中（不超过100cfu ）的微生物，在规定温度下培养不超过规定的最短时间。清楚的观察到与前批已通过测试的培养基的前次测试结果一致。注：有生长就行，无数字上要求。典型特征典型特征典型特征典型特征2. 菌种的质量控制2.1 概念标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。中国药典2010 年版在方法的附录中对菌种的规定同2005 年版在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种有了较为明确的规定允许使用标准菌株和商业派生菌株标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活标准储备菌株应进行纯度和特性确认标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株菌种鉴定简单的讲可以采用目前比较成熟的商品化鉴定技术，如API 鉴定条基本程序为：对疑似菌种进行纯培养进行染色镜检根据染色情况，并结合显色培养基等鉴定的初步信息，选择合适的鉴定条根据操作说明书，得到各生化反应的鉴定结果，通过查阅检索表，得到菌种鉴定的初步结果也可以采用半自动或全自动的微生物鉴定系统菌种的管理菌种的采购菌种的复苏菌种的传代菌种的保藏菌种的使用和销毁菌种的采购每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年度菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。所购菌种均为冷冻干燥菌种。采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，置4～6℃暂存。菌种的复苏菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。菌种复苏应在生物安全柜内操作。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼脂培养基斜面。取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定。菌种的传代应在生物安全柜中进行菌种的传代。取经过纯度鉴定的第1代菌种管（琼脂培养基斜面培养物）用于传代制备第2代菌种。接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在规定的温度下培养适宜的时间，芽孢杆菌宜培养5～6天，黑曲霉宜培养5～7天，其他菌种一般培养18 ～24 小时。菌种的保藏保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为-70℃。在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括菌名、菌号、传代日期和有效期。所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。该方法保藏菌种的有效期规定为6个月。菌种的使用和销毁本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对外提供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二代低温冷冻菌种。本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领取，并在《菌种领用记录》上记录菌名、数量、领用人等信息。外单位向我所购买菌种，应凭单位介绍信，并注明菌名、菌号、数量，必要时可预约购买。本所保藏的菌种，一般应每年更换原种（每年打开一套冷冻干燥菌种传代制备第1代原种保存）。过期菌种应及时销毁，销毁时应经121℃20 分钟的生物灭活处理。通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法优点操作简便成本低比较容易掌握缺点保存期比较短反复传代有引起变异的可能通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的方法优点保存期较长反复传代导致菌种变异的风险较小缺点操作相对复杂成本较高操作流程相对较长，受到污染的风险较高菌种保藏方法举例申请号/专利号：200810124325 本发明提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培养的方法：将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌液体石蜡后竖直存放入６～８℃的环境温度中保存。所述菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。具体过程为：制备半固体培养基，分装、灭菌，然后培养２－３天，确定无菌后将菌种穿刺接种于半固体培养基中，平行于培养基平面穿刺接种不少于３点。倒入１～２ｃｍ高的无菌液体石蜡，用封口膜密封，竖直存放入６～８℃的电冰箱中保存。采用本发明可延长菌种的保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。斜面保藏法: 一般使用营养琼脂培养基,生孢梭菌使用液体硫乙醇酸盐培养基,在30 ～35℃培养18 ～24 小时.存活时间1～3个月. 斜面保藏的菌种在冰箱中放置应注意控制温度,一般不宜低于4℃, 也可以放置在室温中,但应控制温度不超过25 ℃. 有关菌种的常见问题阳性菌的制备：领取工作菌种，从斜面上取一定量的培养物，稀释至系列梯度的菌悬液，分别测各梯度菌悬液的菌落数。临用时，取相应稀释菌悬液用于阳性试验，同时用平皿法测定加入的菌液中的菌落数。是否可行？对照用菌液的制备应取工作菌种，接种置适宜的液体培养基中，经培养后获得浓菌液，再进行稀释和确定菌浓度菌种传代至第5代时，还能不能用该斜面菌种接种制备工作用菌液严格讲，这种操作是不符合药典规定的。药典所指的传代次数不超过5代，应该是指用于实验的工作用菌液。因此，从保藏的角度看，制备成的斜面保藏菌种只能到第4代。阳性对照是否必须购买菌种？有效期一般为多长时间？对照用菌种应采用标准菌种，一般应外购有效期根据不同菌种，不同的保藏方法而异，如采用斜面移植保藏法，不能形成芽孢的细菌有效期一般为1个月，能形成芽孢的细菌有效期一般为3个月，真菌的有效期为3个月。如何对菌种进行复壮，传代之前是否一定要做微生物学鉴定，确认是否有变异。复壮的方法应根据待复壮的菌种的保藏形式来确定。对冻干菌种，复壮操作较为繁琐微生物传代中的菌种确认是必须的。以短小芽孢杆菌为例说说细菌鉴定通过显微鉴别，为不呈链状排列的杆菌，革兰氏染色为阳性。营养琼脂斜面上菌苔光滑，薄，闪光，蔓延，不粘着，常常是浅黄色。生化试验可选做明胶穿刺、淀