高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography  （HPLC）  一、前言 参考书籍： 1.色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编） 2.高效液相色谱法（邹汉法、张玉奎、卢佩章编著） 3.高效液相色谱方法及应用  （色谱技术丛书、化学工业出版社、 于世林编著) 第一章、高效液相色谱的基本原理 §1-1 概述 一、发展历史 1903年提出、1969～1970年开始发展 流动相－－液体 基本原理：在经典液相色谱基础上，引入             气相色谱理论 技术：采用高效固定相、高压泵、高灵敏检测器 实现：分析速度快、分离效率高、操作自动化      工作原理：     通过高压泵，连续地将流动相按一定流速流过柱子；通过进样器，注入样品混合物。由于混合物中各组分性质不同，因而它们在柱内移动速度不同而逐渐分离。通过检测器检测，得到组分的电信号并进行放大；记录仪将放大的电信号以图形形式记录下来。               高效液相色谱法特点： 1.高压：一般：150～300kg/cm2             甚至：500kg/cm2 2.高速：两相间交换：千分之几秒            分析时间较经典法少很多(几分~几十分钟) 3 高效：气相：2000塔板/米             液相：5000塔板/米 4.高灵敏度：紫外检测器：10－9g数量级                    荧光检测器：10－11g(百万分之几）                    试样量小（几微升） 5.高选择性：可分析在性质上极为相似化合物      （手性化合物、同位素、同分异构、空间异构）                         HPLC的分类：     ⅰ液固吸附色谱（LSC)      （ 利用样品分子在固定相上吸附性能差异而分离）     ⅱ液液分配色谱（LLC） （利用样品分子在两相中分配系数不同导致溶解度不同而分离）      （键合相色谱 60％）     ⅲ离子交换色谱（IEC） （利用样品分子的电荷性、导电性不同，导致对固定相的亲合力不同而分离）     ⅳ体积排阻色谱（SEC) （利用溶质分子大小不同导致对固定相的渗透力不同而分离） §1-2 色谱分离和保留值 一、色谱过程 定义——由于样品中各组分在不互溶的两相间平衡                分配的不同，在色谱柱中进行分离的过程   固定相：柱中固定不动   移动相：流过柱子的液体 综合来看：不同组分分离状况取决于： ⅰ热力学平衡问题：各组分分配系数、吸附力、亲                           合力之间差异——影响出峰时间 ⅱ动力学平衡问题：溶质扩散系数、填料颗粒、填                           充情况、流速——影响峰形 ?  二、容量因子和保留值   色谱的保留作用——化合物进入柱内，即在两相间不断进行平衡分配，由于不同化合物理化性质不同，在两相中存在量也不同。固定相中量多，柱内保留时间长；流动相中量多，柱内保留时间短。 容量因子k′——某一组分平衡时，两相中存在量的比值。要得到理想分离， k′应保持在1～10之间 k′太小——没有充分利用填料  的分离能力。 k′太大——分析时间太长。   §1－3色谱柱的分离效率 分离过程基本理论： ⅰ各组分在两相间分配情况：tR ——由色谱过程的热力学因素所控制  ⅱ各组分在色谱柱中的运动情况：Y1/2 ——由色谱过程的动力学因素所控制 一、理论塔板数N 二、理论塔板高度H 三、峰扩展和速率方程式 峰扩展——某一组分流过时，经过多次平衡分配，使开始处于“浓缩”状态的组分被移动相稀释，最后得到有一定宽度的色谱峰，称之。 柱外因素：ⅰ检测器流动池体积                 ⅱ柱出口到检测器的连接管                 ⅲ进样器死体积 柱内峰扩展影响因素： ①涡流扩散 减小措施：ⅰ颗粒大小保持一致           ⅱ填装均匀           ⅲ尽量采用球型填料 涡流扩散随柱长增加而增加，与流动相流速无关。 ②分子扩散 减小措施：加大流动相流速 ③传质 ——溶质分子在两相间浓度的不同，从浓度高的相，不断迁移至浓度低的相，直到浓度达到平衡，这种质量迁移过程称之。 ⅰ固定相传质：⑴固相固定相                       ⑵液相固定相 ⅱ移动相传质：⑴迁移移动相                       ⑵滞留移动相 获得高柱效的几种方法： ①选用细的颗粒填料 ②流动相流速低 ③流动相粘度小 ④升高温度 溶质扩散系数与其结构有关 ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大 第二章    仪器装置 液相色谱仪可分为四大系统：    泵系统   进样系统   分离系统   检测系统      泵系统 泵系统发展趋势 ①高效：填料颗粒↓→分离效率↑→                柱压降↑→泵的工作压力↑ ②分析时间短：更快流速→柱压降↑ ③减少洗脱液用量 ④液相色谱的多元洗脱系统 §2－2  分离系统（色谱柱） 组成：精密管径的不锈钢管、填料、柱接头 要求：①柱管内壁非常光滑          ②柱接头设计要保证系统中引入最小             死体积          ③能密封高压液体          ④两端加过滤片  柱效的影响因素 ①填料的颗粒度及其均匀性 ②柱长、填装的方法与技巧 常用：内径2－5mm（4.6mm) 柱效一定时，柱长与颗粒度成正比 例如：颗粒度5～10um、柱长15～30cm           颗粒度3～5um、 柱长7.5～15cm  进样系统 检测系统 PAD检测器 第三章、液固色谱、液液色谱、键合相色谱 §3－1 液固吸附色谱 一、原理:       固定相是极性吸附剂，由于不同官能  团样品具有不同极性，因而对固定相的吸  附能力不同。极性越大，吸附能力强；极  性越低，吸附能力越弱而导致分离。 分离对象： ①官能团有差别的不同类型化合物 ②几何异构体（由于固定相表面是刚性结构，即吸附中心处于吸附剂表面一定位置上。溶质分子官能团与吸附中心的相互作用随分子的几何形状而改变，当官能团与吸附中心对准，作用就强。） 二、填料的类型及其选择 ①按形状分：a. 球形  b. 无定形 ②按多孔程度分：a. 多孔型  b. 薄壳型 ③按极性分：a. 极性   b.非极性 三、硅胶的活性控制及标准化 市售未处理硅胶→加热4－6小时，活化去水 。再加进定量水分，使吸附剂含水量保持恒定。 四、吸附强度分类 根据化合物结构类型，可将它们 在硅胶上 的吸附强度排序：P186 归纳： ①官能团不同→极性不同→吸附强度不同 ②几何异构体→空间位置不同→吸附强度不同 五、流动相选择的实用要求 ①溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性 ②避免使用与固定相发生不可逆反应溶剂 ③流动相应与检测器相匹配 ④使用的溶剂应当易于除去，不干扰对分离组分的回收 LSC流动相分类 ⑴根据所起作用分为： ①底剂    ②洗脱剂 ⑵根据氢键、酸碱性基团分类： ①无氢键型      ②斥电子氢键型 ③吸电子氢键型  ④具斥、吸电子双重性的氢键型  ⑤酸类              ⑥碱类 LSC
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