HPLC色谱常见问题
1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？
2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？
3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？
5.我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不重现，为什么？
6.我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？
7.色谱双峰产生的可能及判断和处理
8.色谱柱中的流动相会排干吗？
9.使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？
10.液相色谱梯度洗脱中柱温的影响有那些？
11.为何基线漂移规则的基线噪音不规则的基线噪音除了流速外，还有哪些因素能引起压力改变？20.什么是强溶剂、弱溶剂？.怎样才会使峰位发生重排？.除了在线脱气常用的实验室脱气方式有哪些？.评价一个色谱柱的？.什么是时间常数？.为什么在实验过程中有时会出现倒峰？.为何会出现“胖”峰和平头峰？怎样避免？.什么是次级保留效应？.前延峰的发生及处理？.峰变宽的原因？.柱平衡慢的常见原因有哪些？.用内标法实验时对内标物的要求有哪些？.管子切割注意事项？.什么是HPLC的“无限直径效应”？.如何评价一台检测器？    许多色谱工作者在操作液相色谱时，色谱柱是在室温环境下工作的。如果实验室的温度能保持不变的话，不会有什么大问题。但大多数的工作环境温度是不断变化的，因此若想将在某实验室开发的一种液相色谱方法应用到其他实验室的话，温度的差别就会引起较复杂的问题。温度的影响在所有的色谱分析方式中都是存在的，本文就来讨论液相色谱方法中的梯度洗脱方式受温度影响的问题。
    等度保留
    大多数色谱工作者知道等度洗脱时温度会影响保留时间。图1显示了三个不同温度下的分离结果。我们发现当温度升高时所有的色谱峰都前移了，等度洗脱时一般温度每升高一摄氏度保留时间会缩短1-3%，在图1中，保留时间变化率约为2%/℃。          
    拥有温控系统的实验室一般都有全天候温控设置，但这种设置可能引起室温显著变化，这对整夜运行的色谱系统就会有一些影响，例如我们实验室的夜间温度就设为4-7℃。在不同的季节，实验室的夜间温度可能比正常工作日的温度高或低，这种温度的变化就会使色谱峰离开“保留时间窗”，造成连续进样中产生一系列的无效数据。
    还有一个可能的温度影响因素就是色谱仪器在实验室的位置。当色谱柱正对着空调的送风口时，虽然整个实验室的温度非常稳定，但色谱系统的温度就会不断的变化。这就是我们要使用柱温箱的原因之一。
    梯度保留
    温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的。图2是苯胺和苯酸在三个温度条件下的色谱图。图1中，20℃的温度变化引起保留因子的变化大约为两倍，然而在图2中，40℃的变化使保留改变了约20%。平均来说，图2中的色谱保留变化约为0.2%/℃。由此可见，温度变化对梯度洗脱的影响要小于对等度洗脱的影响（假定本例具有普遍代表意义）。即便如此，若梯度洗脱时不控制温度的话，保留值一般都会有较大的变化。
    选择性的变化
    比较图1和图2会发现温度变化能引起选择性显著变化。图1中，25℃时第二个峰和第一个峰很接近，但当温度升高后，第二个峰却远离第一个峰，接近第三个峰。从三个图来看，对于前三个峰的最佳分离条件是35℃。值得注意的一个有趣现象是，选择性的变化是和成分相关的，例如图1中当温度变化后最后三个峰的相对位置几乎不变。
    在图2的梯度洗脱示例中，也有选择性变化。峰1、2、4和5的相对位置没有十分明显的变化，但是，当温度升高时，峰3会移近峰4。
峰位置的相对变化和温度的变化是有规律可循的。当条件确定以后，这个规律就是可预测的。例如，在图2中当温度升至77℃以上时，峰3和峰4将会合并。而当温度更高时，峰3将会移到峰4之后。温度引起的选择性变化的多年来一直未受重视。最近，施耐德等人发现能够将温度作为一个调整选择性的有力工具。图1中的样品在35℃时可以达到最佳选择性（峰之间的距离最大），而图2中的样品在38℃时可达到最佳选择性（这两份样品的最优温度近似纯属巧合）。
温度控制
    从实践出发，图1和2的例子说明为了获得一致的结果我们必须要控制柱温，使用柱温箱是最好的办法。目前商业化的柱温箱有两种形式：直接加热色谱柱和通过空气传热，每种设计都有其优缺点，而且不同厂商设计的LC系统也有不同的限制。在直接加热型柱温箱中色谱柱是被夹在金属加热器中或被加热器包裹起来；而在空气传热型的柱温箱和气相色谱柱温箱很相像，色谱柱是被悬挂在静止或流动的空气中，通过加热空气来保持柱温。第三种设计是把色谱柱浸在液体中（比如水浴中），这在实验室中很容易搭建，但通常这种设计也并不比其他设计省力。          
    如果没有柱温箱，最有效的办法就是将色谱柱隔绝在一个温度波动最小的地方。例如，可把色谱柱置于泡沫塑料套中或色谱包装盒中，当实验室温度基本不变时效果很好，但这种方法必须要允许保留有一些波动。隔绝色谱柱也可以避免结果受环境温度影响。
    温度平衡
    我们知道，为了保证分离的重现性，色谱柱在梯度洗脱状态下的必须有平衡过程。当一次梯度洗脱分离完成后，一定要用10-15倍柱体积的流动相来冲洗柱子以恢复柱子的平衡。例如，如果使用B溶剂5-100%的梯度，柱子为150mm´4.6mm(柱体积为1.5ml)，当流动相从100%的B溶剂换回到5%的B溶剂时，大概需要保持1.5ml/min的流速10分钟来恢复系统平衡，在进行下一次梯度变换之前如果系统没有平衡,那么保留时间的重现性就会很差。
    正如柱子不能完全平衡将导致保留时间的重现性差一样，柱温不平衡也会导致不理想的后果，这个问题在峰宽上的影响尤其明显。当温度变化时除了选择性和保留时间的变化之外，峰宽也会发生变化。升高温度通常会使理论塔板数（N）升高，峰宽变窄，由于峰面积不变，峰越窄就会越高，因此升高温度可以达到更小的检测限。（这篇文章里的色谱图不是按同一个y轴比例来画的，所以峰高的变化没有表示出来）
   不用平衡的流动相充分的冲洗柱子会导致化学不平衡状态，但是当柱子在程序升温的环境中我们怎样确定不平衡问题呢？答案取决于柱子中的流动相，如果柱子是在室温条件下，溶剂瓶、泵和自动进样器也在室温下，那么整个系统中的温度就应该是稳定的。但是，如果柱子是热的，系统的其他部分和溶剂是室温，柱头将比柱尾凉。柱子里的温度变化将会影响峰形。
    图3所示色谱图中柱温为38℃，进柱的溶剂为室温（约22℃），最后一个峰有很明显的变形。把溶剂瓶、泵、自动进样器加热至与柱温相同是不现实的，所以溶剂预热器是最好的选择。我们用1米长，0.25mm内径的不锈钢管作为预热器，把这个不锈钢管盘成直径大约10cm的平面紧贴在柱温箱里的预热器上，再让流路垂直以便预热器能够位于自动进样器和柱子之间，这样，凉的溶剂从自动进样器里出来到柱子之前经过这个预热盘升高了温度。图3中的上面一个色谱图就是增加了预热器使峰形得到改善。有一些商品柱温箱就包括这个预热器。
    当流动相和柱子之间的温差增大时，由温度不平衡而导致的峰变形就会加剧。比较图3-5你会发现这个问
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