PCR技术及其发展和应用 张雪梅 检验系临床生化教研室 主要参考书 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构（发夹结构）。 （5）两引物间避免有互补序列（二聚体）。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 3. 得到的引物结果 引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC 纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。   普通PCR：OPC纯（ 95%）   较长引物（大于50个碱基） ：PAGE纯（ 95%）   经过修饰或标记的引物：HPLC纯（  99%,但价格昂贵） 引物浓度：0.1-0.5 ?mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。 （3）耐热DNA聚合酶 1）Taq DNA聚合酶（Taq polymerase） ： 95℃的半寿期为40min  最适温度（72℃）时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸  酶活性（受多种因素影响）： 5’→3’方向的聚合酶活性， 5’→3’方向的外切酶活性和逆转录酶活性， 非模板依赖性活性，可在双链PCR产物每一条链的3‘端加上单核苷酸尾，使PCR产物的3’端突出一个单A核苷酸尾  2）其他的耐热聚合酶 Tth DNA聚合酶：在高温和MnCl2存在的条件下，能有效地逆转录RNA。用于一步法RT-PCR。  Vent DNA聚合酶：又称Tli DNA聚合酶，该酶耐高温且具有3‘-5’外切酶活性的校对功能，其保真性较Taq DNA聚合酶高一倍。该酶扩增长片断（ 12kb）的功能较强。  Pfu DNA聚合酶 ：具有3’→5’外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于 2kb的片断扩增。 二、PCR的衍生技术                        逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）                     ???反向PCR（inverse PCR）                     ?? 巢氏PCR（nesting PCR）                      ?? 原位PCR（in situ PCR）                         多重PCR（multiplex PCR）                        多重等位基因PCR（multiplex allele PCR）                      ?? 不对称PCR（asymmertric PCR）                     ???锚定PCR（anchored PCR）                     ???长片段PCR（long fragment PCR）                        荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR） 1、逆转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)  影响因素 （1）模板对RT-PCR的影响        对RNA制品的纯度和完整性要求都极为严格  （2）逆转录酶对RT-PCR的影响        MLV逆转录酶能合成大于2kb的较长cDNA，但对热的稳定性较AMV逆转录酶差。  （3）逆转录引物对RT-PCR的影响      随机引物：原核细胞多用      oligo(dT)：真核细胞多用      基因特异性的引物（GSP）：特异性强，广谱性低  例子： S.pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响 a、RNA的提取：      野生型和转化缺陷型S.pn都诱导转化后，采用Qiagen试剂盒进行总RNA提取。  b、cDNA的制备：       取RNA 2μl，随机引物1μl，DEPC水9μl，混匀后，70℃变性5min，立即置于冰上。然后顺序加入逆转录buffer 5μl，dNTP 1.5μl, RNasin 0.5μl, DEPC水5μl, 逆转录酶M-MLV 1μl。混匀后于37℃，1小时，得到cDNA。 c、PCR扩增:        PsaA的引物3μL，cDNA 1μL，Tag plus酶0.2μL，共30μL体系。循环参数：94℃ 30秒，55℃ 40秒，72℃ 45秒，循环30次。用16s rRNA的PCR产物为标准物，2%琼脂糖电泳。 4、突变PCR （1）随机突变： 应用：构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体  策略：易错PCR（error-prone PCR）。 利用Taq DNA聚合酶等耐热DNA聚合酶不具有3′→5′校对功能的特性，在PCR扩增反应中可能掺入错误的核苷酸，从而产生随机错误的扩增产物。 加入次黄嘌呤核苷酸并限制某一种核苷酸的用量，从而促进DNA聚合酶选择其它3种核苷酸或次黄嘌呤核苷酸，导致扩增产物发生突变。 （2）定点突变 （1）5‘端引入突变：通过修饰上游引物的5’ 端，即可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。  （2）序列中的单位点突变：采用重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR) （3）多位点突变 策略：多次重叠PCR 关键：重叠引物的设计（每对突变引物需要部分重叠，方向相反）。 C(t)值的重现性 相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；C(t)值具重现性 C(t)与初始模板含量 初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系 优点 使用方便 	   --- 不必设计复杂的引物  没有序列特异性      --- 可以用于不同的模板  便宜  灵敏 例子：荧光定量PCR检测肺炎链球菌comE基因转录水平  方法流程： 1、标准品制备：普通PCR扩增出comE基因片断→装入克隆质粒→定量稀释为109拷贝作为标准品备用 2、定量检测comE基因表达水平：提取RNA→逆转录成cDNA→与成10倍梯度稀释的标准品一起作为模板，同时进行荧光定量PCR→根据实验数据分析结果→得到其表达的绝对量。 优点 对目标序列有很高的特异性           ---特别适合于SNP检测 与 Molecular Beacons 相比设计相对简单 是目前应用最广泛的一种技术                         PCR只是一个简单的不起眼玩艺                       ——凯利·穆利斯（Kary Mullis)             PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 …            它最大的特点就是能不断推出新形式。            
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