* 电泳槽 SDS-PAGE蛋白电泳上样缓冲液?        蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE?loading?buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。 ???    本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务必注明，仔细区分。?  注意事项??     分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中含一定量的DTT或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较易区分； ??? ???含巯基的试剂有一定的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。?   使用说明???? 1. 按每4微升蛋白样品加入1微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。 ????2.?100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 ????3.?冷却到室温后离心数秒钟，混均后再离30秒钟，取上清直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 ????4.?通常电泳时染料到达胶的底端附近（0.5-1cm)即可停止电泳。 增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。  上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。  指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。  SDS-PAGE蛋白电泳上样缓冲液? 单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称的卡诺氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15分钟至24小时，冰箱、室温均可。  甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20?左右)，可使材料变硬。 冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用0.3-0.5?的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。  甲醇/冰醋酸固定液 考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）? ?     考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。     考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。     蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5μL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100μg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10μg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）         测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 Triton-100   Triton-100洗涤剂 透压的裂解去垢剂（ ）通过形成微团能溶解细胞膜的疏水结构。 是温和的，非离子的去垢剂，不会使得蛋白质变性（相比较接下来即将要 用到的SDS 来说）。 * 
SDS-PAGE原理(下).ppt