一、简介流式细胞仪 (一)流式细胞仪概念 流式细胞术(Flow Cytometry ,FCM)是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒(如细菌)逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。 简言之,流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪,是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质,如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术,FCM以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色,广泛应用于基础研究和临床实践各个方面,包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等,在各学科领域发挥着重要的作用。 (二)原理 待测样本的细胞悬液,在鞘液的包围和约束下,细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷出,形成细胞液柱。当液柱通过检测区,在入射的激光束照射下产生前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC),它们分别反映细胞大小和颗粒度,根据这些特性可以将细胞分类。经一种或几种特殊荧光标记的样本,在激光束的激发下所产生的特定荧光,可被光学系统检测并输送到计算机进行分析,得到细胞相应的各种特性。 (三)流式细胞仪检测的细胞特性 细胞结构组成细胞功能 大小细胞表面、胞浆、核特异性抗原 粒度细胞活性 DNA、RNA 含量胞内细胞因子 蛋白质含量激素结合位点 钙离子、pH值、膜电位酶活性 二、流式细胞仪的临床检验项目 目前在国内最常见的临床应用有两大类:一为肿瘤细胞的DNA 含量析; 另一为细胞表面的表型测定,包括淋巴细胞亚型分析、免疫功能监测、白血病和淋巴瘤免疫分型、残余白血病检测、以及HLA-B27 组织抗原检测等等。 1、淋巴细胞亚群分析 淋巴细胞亚群分析可以通过相对计数、绝对计数与率的变化监控疾病状态下的免疫状况(如肿瘤、感染性疾病、免疫性疾病等),以此辅助诊断、追踪病情发展及决定用药时机。 检测原理:利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合,再配合多色荧光染料,即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来,进而得到各亚群的相对比例。最常检测的亚群包括T 细胞(CD3)、B 细胞(CD19)、NK 细胞(CD16+56)、辅助性T 细胞(CD3+CD4+)和抑制性T 细胞(CD3+CD8+)等。 应应用用实实例例::M Mu ul lt ti iS SE ET T 系系统统利利用用C CD D1 14 4/ /C CD D4 45 5 设设门门技技术术精精确确检检测测淋淋巴巴细细胞胞亚亚群群 比比例例。。 * * 其其中中绿绿色色细细胞胞群群体体为为淋淋巴巴细细胞胞,,红红色色为为单单核核细细胞胞,,蓝蓝色色为为粒粒细细胞胞。。 2、DNA 分析 肿瘤细胞的DNA倍体分析是流式技术另一重要应用,临床上可对一些恶性肿瘤进行早期诊断,跟踪随访和早期治疗,大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。 检测原理:正常人体细胞的DNA含量是二倍体,细胞群体具有特定的增殖比例。通过检测细胞的DNA含量和增殖比例,可以了解细胞群体的倍体性和增殖能力。具体操作时,先将实体组织制备成单细胞悬液,用固定或去污剂在细胞膜上打孔,使DNA特异的荧光染料如PI(碘化丙啶)导入细胞核,PI和DNA缄基对特异结合后上机检测PI的荧光强度,并进行数据分析。 应用实例:乳腺癌病人的手术标本分析图。 * *其其中中红红色色群群体体为为二二倍倍体体,,黄黄色色群群体体为为异异倍倍体体。。 3 3、、 白白血血病病和和淋淋巴巴瘤瘤免免疫疫分分型型 正常白细胞在其分化过程中,随着系列的不同、成熟阶段的差异,会在细胞膜表面表达不同的分化抗原。白血病细胞则在癌变的过程中,丧失了正常细胞底系列专一性和分化阶段规律性,在本质上有别于正常骨髓细胞。应用此特点可进行免疫表型分析,以鉴别各种白血病和淋巴瘤,辅助临床诊断、评估疗效和预后。 常用的抗原包括:CD3、CD5、CD7、CD19、CD20、CD22、CD10、HLA-DR、 CD13、CD14、CD33、CD34、GLY-A、MPO等等。 应用实例:利用CD45三色分析急性髓性白血病。 * 左图为正常骨髓,绿色为正常淋巴细胞,深红为单核细胞,玫瑰红为成熟粒细胞,浅蓝为有核红细胞,深蓝为未成熟细胞;右图为急性髓性白血病图形,可见与正常明显的差别。
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