第三章PCR 引物设计PCR 技术的应用研究领域：基因克隆、测序、重组疾病诊断法医鉴定亲子鉴定古生物学研究PCR 及其衍生技术兼并引物PCR RACE 反向PCR （IP-CR ）差异展示PCR(DD-PCR) 多重PCR TD-PCR PCR-SSCP Net-PCR IC-PCR Hotstart PCR SPA PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。引物是PCR 特异性反应的关键。1 、引物设计的原则 引物要跟模板紧密结合；引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在；引物不能在别的非目的位点引起高效DNA 聚合反应(即错配)。引物设计需要考虑的因素引物长度（primer length ）产物长度（product length ）序列Tm 值(melting temperature) ΔG 值(internal stability)  引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin ）错误引发位点（false priming site ）引物及产物GC 含量（composition ）有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。引物设计要点（1）一般，引物的长度为16-23bp ，常用的长度为18-21bp 。引物设计要点（2）引物3′端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。3′端防止连续三个C或G 引物的GC 含量一般为45-55% ，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。引物设计要点（3）引物的Tm 值。过高（>72℃）或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的Tm 不能相差太大。引物设计要点（4）ΔG 值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标。一般情况下，引物的ΔG 值最好呈正弦曲线形状，即5′端和中间部分ΔG 值较高，而3′端ΔG 值相对较低，且不要超过9（ΔG 值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。原理: 引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合。因此，5′端与中间段的ΔG 值应较高，而3′端ΔG 值影响DNA 聚合酶对模板DNA 的解链，过高则不利于这一步骤。引物设计要点（5）可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100 ，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。引物设计要点（6）引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5 ，否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行。引物设计要点（7）对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。2、引物的自动搜索和评价分析软件的引物设计功能主要体现在2个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。一般认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。3、引物设计软件常用的引物设计软件Primer Premier 5 Oligo 6  WONDERFUL 生物信息学系统Primer Premier 5.0 的使用技巧简介简并度的计算：简并引物：有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。使用步骤及技巧点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。5′加入酶切位点注意事项(1) 选择简并性低的氨基酸区域。整体评价该软件是一款功能全面的引物设计软件，全面地给出了各种参数，并在多个必须的地方给出有效的评价。但是程序在设计中还有一些不足。如：产物的Tm 值和引物的Tm 值之间的差异也未能给出评价，如果二者差异较大（>22 度），则容易造成退火时引物-模板和模板-模板火之间的竞争。结果输出方面，只能以图文格式打印，无法转成文本格式http://www.book118.com.226/wanshan/wlzy.htm 解压密码：wanshan.net 在Win.ini 中把vspace=DU 改为vspace=PU 便可以使用全部功能Oligo 6.71 使用技巧简介使用Oligo 6.71 的启动界面如下：在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower 。如果PCR 的模板不是基因组DNA ，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130 ，那么这对引物也是可以接受的。http://www.book118.com/oli6installer.zip DNAClub DNAMAN http://www.book118.com.edu/biotools/oligocalc.html 设计简并引物Premier Primer 5 提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1 、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear ）2 、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion ）3 、支原体（Mycoplasma ）4 、植物线粒体（Plant Mitochondrion ）5 、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion ）6 、一般标准（Standard ）7 、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion ）8 、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion ）(2) 根据生物使用密码子的偏性，选择使用率最高的密码子，进一步限定引物的简并度。(3) 引物的3′端不应存在简并。功能在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。其初始界面有3个图：Tm 图、ΔG 图和Frq 图（其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性）。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的G 值在5′端和中间值比较高，而在3′端相对低。Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5′到3′的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 是邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。Frq 曲线揭示了序列片段存在的重复机率大小。该频率高则增加错误引发的可能性。选取引物时，宜选用3′端Frq 值相对较低的片段。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。首先，检查引物二聚体尤其是3′端二聚体形成的可能性。第二项检查是发夹结构（hairpin ）。一般来说，能值以不超过4.5 为好。第三项检查为GC 含量和Tm ，以45-55 ％为宜，并且应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近。当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。* * Bioinformatics RAPD Real time PCR LD-PCR Tall-PCR Marathon PCR 原位PCR RT-PCR 不对称PCR Overlapping PCR …….. PCR 原理高温变性低温退火适温延伸理论上，只要知道任何一段模板序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR 就可将模板DNA 在体外大量扩增。PCR 引物是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA 模板链互补，另一个与感兴趣区域另一端的另一条DNA 模板链互补。PCR 产物长度≤500bp 引物长度16 ～18 bp PCR 产物长度≈5kb 引物长度≈25bp PCR 纪录：23bp 长度引物扩增出40kb 产物(3) 精确算法（邻近热力学）(4) Ta OPT 算法：邻近热力学例：ACGG 和其互补TGCC 结合的ΔG ： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG) = -(1.3+3.6+3.1) = -8.0 kcal/mol 错配（或称假引发）：将导致产生非专一产物1、发夹结构（Hairpin ）自身互补2 、二聚体（Dimer ）两个引物间互补售价US$ 885 售价US$ 1200 售价1700RMB 引物设计限制性内切酶位点分析motif 查找同源性分析功能序列“朗读”DNA 与蛋白序列的互换简并引物设计功能功能：例如“, Ala Asn Ile Lys Met”的引物 Ala = 4, Asn = 2, Ile = 3, Lys = 2, Met= 1 4 ×2 ×3×2 ×1 = 48 Preimer Premier 启动界面复制序列粘贴到此处进行引物设计时，点击按钮如果没有特殊要求，建议使用默认设置。引物长度引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围手动，自动5对引物每对产物的大小引物分值100 分为满分该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin ），二聚体（Dimer ），错误引发情况（False Priming ），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer ）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成。*