复制的高保真性(high fidelity) 复制的三个重要特点半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication) 一、半保留复制的实验依据和意义DNA 生物合成时，母链DNA 解开为两股单链，各自作为模板(template) 按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA ，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA 都和亲代DNA 碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。密度梯度离心二、双向复制原核生物复制时，DNA 从起始点(origin) 向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。聚合反应的特点DNA 新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5  →3 方向进行。二、DNA 聚合酶全称：依赖DNA 的DNA 聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol DNA-pol  Ⅲ空间结构模型（二）DNA-pol 的核酸外切酶活性和及时校读细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S 及G2→M 的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF) 。增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA) 在复制起始和延长中起关键作用。3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNA 分子。引物3' HO 5' 引物酶（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol 催化下，dNTP 以dNMP 的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。5'  3' 5' dATP dGTP dTTP dCTP dTTP dGTP dATP dCTP OH 3' 3' DNA-pol 目录复制过程简图目录目录一个DNA-polyⅢ同时指导两条子链合成辛勤工作中的DNA-poly Ⅲ模式图原核生物基因是环状DNA ，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter) 处汇合。ori ter E.coli 82 32 ori ter SV40 50 0 （三）复制的终止5 5 5  RNA 酶OH P 5  DNA-pol ⅠdNTP 5 5  P ATP ADP+Pi 5 5  DNA 连接酶随从链上不连续性片段的连接目录哺乳动物的细胞周期DNA 合成期G1 G2 S M 二、真核生物的DNA 生物合成（一）复制的起始3 5 5 3 领头链3 5 3 5 亲代DNA 随从链引物核小体（二）复制的延长染色体DNA 呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA 子链上最后复制的RNA 引物，去除后留下空隙。（三）复制的终止5 3 3 5 5 3 3 5  + 5 3 3 3 3 5 5 目录目录切除引物的两种机制目录端粒(telomere) 指真核生物染色体线性DNA 分子末端的结构。功能维持染色体的稳定性维持DNA 复制的完整性结构特点由末端单链DNA 序列和蛋白质构成。末端DNA 序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…正常端粒(telomere) 有关端粒对寿命的争论Dolly  死于6岁第一个克隆生物母羊多莉(1996-2003) 多莉与自己的幼崽端粒酶(telomerase) 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)  组成各种DNA 聚合酶的共同三维结构示意图聚合酶活性中心外切酶活性中心（一）原核生物的DNA 聚合酶DNA-pol ⅠDNA-pol ⅡDNA-pol  Ⅲ（一）原核生物的DNA 聚合酶功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-pol Ⅰ（109kD ）323 个氨基酸小片段5  核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段604 个氨基酸DNA 聚合酶活性5  核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol ⅠKlenow 片段是实验室合成DNA ，进行分子生物学研究中常用的工具酶。DNA-pol Ⅱ（120kD ）DNA-pol II 基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA 损伤的应急状态修复。功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA-pol  Ⅲ(250kD) 四个功能部分：核心酶--- 催化核苷酸聚合和校正β亚基--- 套环，套住DNA γ复合体--- 加载β亚基τ亚基--- 连接，具柔韧性（二）真核生物的DNA 聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA 复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol （二）真核生物的DNA 聚合酶三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）复制的保真性和碱基选择（二）DNA-pol 的核酸外切酶活性和及时校读（一）DNA-pol 的聚合活性中心可以选择核苷酸与新进入的正确核苷酸形成氢键，否则聚合活性大大降低。一旦错配，DNA 将掉入外切活性中心聚合酶活性中心外切酶活性中心A：DNA-pol 的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B ：碱基配对正确，DNA-pol 不表现外切活性。1. 遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3. 复制出错时DNA-pol 的及时校读功能。DNA 复制的保真性至少要依赖三种机制四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化DNA 分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA 解成单链，它才能起模板作用。（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA 结合蛋白E. Coli 基因图目录解螺旋酶(helicase) ——利用ATP 供能，作用于氢键，使DNA 双链解开成为两条单链引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA 引物的酶单链DNA 结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整10 8 局部解链后（二）DNA 拓扑异构酶(DNA topoisomerase)  解链过程中正超螺旋的形成目录拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ分类拓扑异构酶Ⅰ切断DNA 双链中一股链，使DNA 解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA 变为松弛状态。反应不需ATP 。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA 分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP 供能，连接断端，DNA 分子进入负超螺旋状态。作用机制目录五、DNA 连接酶连接DNA 链3 -OH 末端和相邻DNA 链5 -P 末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA 链连接成一条完整的链。DNA 连接酶(DNA ligase) 作用方式HO 5’3’3’5’DNA 连接酶ATP ADP 5’3’5’3’目录DNA 连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA 修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能DNA 生物合成过程The Process of DNA Replication 第三节（一）复制的起始需要解决两个问题：1 . DNA 解开成单链，提供模板。2. 合成引物，提供3 -OH 末端。一、原核生物的DNA 生物合成E.coli 复制起始点oriC GATTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ··· 1  13 17 29 32 44 ···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA 58  66 166 174  201 209  237  245 串联重复序列反向重复序列5 3 5 3  DNA 解链起始点(oriC) 的特殊序列(1)DnaA 蛋白首先解链DnaA 蛋白结合反向重复序列更多的DnaA 蛋白结合，引起DNA 缠绕DnaA 蛋白作用串联重复序列，引起解链(2)DnaB 蛋白解旋DnaB 蛋白解旋SSB 结合，保持单链Dna A  Dna B 、Dna C DNA 拓扑异构酶引物酶SSB 3 5 3 5  2 . 引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC 蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。* 目录* 目录中心法则DNA RNA 蛋白质复制转录翻译逆转录第三篇基因信息的传递DNA 的生物合成( 复制) DNA Biosynthesis ，Replication  第十章复制(replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA 为模板合成子链DNA 的过程。复制亲代DNA 子代DNA 复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication  第一节半保留复制的概念左:MATTHEW MESELSON ；右:FRANKLIN W. STAHL A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G T C C A T G A C T C C A T G A C A G G T A C T G A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C + 母链DNA  复制过程中形成的复制叉子代DNA  目录子链继承母链遗传信息的几种可能方式全保留式半保留式混合式CsCl 溶液形成密度梯度加入样品超速离心(>25Krpm) 进行分离超速离心分离结果密度梯度实验——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA 的细菌培养于普通培养液第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果密度梯度离心对假设的支持与否定按半保留复制方式，子代DNA 与亲代DNA 的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。复制中的放射自显影图象A. 环状双链DNA 及复制起始点B. 复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点(termination, ter) ori ter A B C 大肠杆菌染色质DNA 复制的放射性自显影照片5’3’ori ori ori ori 5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’三、复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向3′5′3′3′5′领头链(leading strand) 随从链(lagging strand) 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment) 。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。DNA 复制的酶学The Enzymology of DNA Replication 第二节参与DNA 复制的物质底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA 的DNA 聚合酶，简写为DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA 母链引物(primer):  提供3 -OH 末端使dNTP 可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子一、复制的化学反应(dNMP)n + dNTP →(dNMP)n+1 + PPi  目录5’3’5′end 3′end C G A 活性：1 . 5  3 的聚合活性2. 核酸外切酶活性5′A G C T T C A G G A T A  3′|  |  |  |  |  |  | |  |  | | 3′T C G A A G T C C T A G C G A C 5′3  5 外切酶活性5  3 外切酶活性? 能切除突变的DNA 片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性目录首先发现DNA 聚合酶的A.Kornberg A.Kornberg 在端详DNA 聚合酶模型(摄于1965 年，斯坦福大学生物化学系) A.Kornberg1959 年获得诺贝尔奖后全家福，摄于斯德哥尔摩。* * * *