在生物界，RNA 合成有两种方式：一是DNA 指导的RNA 合成，也叫转录，此为生物体内的主要合成方式，也是本章介绍的主要内容。另一种是RNA 指导的RNA 合成(RNA-dependent RNA synthesis) ，也叫RNA 复制(RNA replication), 由RNA 依赖的RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase) 催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA 病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA 为模板合成RNA 的方式。转录的知识是理解许多生物学现象和医学问题所必需的。对于RNA 生物过程的调节可以导致蛋白质合成速率的改变，以及由此而引发的一系列代谢变化，因此，了解RNA 代谢的基本原理就甚为重要。这些原理既关系到所有生物是如何适应环境变化的，也关系到细胞结构和功能的分化机制。DNA 依赖的RNA 聚合酶催化合成RNA ；RNA 合成的化学机制与DNA 依赖的DNA 聚合酶催化DNA 合成相似。DNA 聚合酶在启动DNA 链延长时需要引物存在，而RNA 聚合酶不需要引物就能直接启动RNA 链的延长。RNA 聚合酶和DNA 的特殊序列——启动子(promoter) 结合后，就能启动RNA 合成。三、RNA 聚合酶结合到DNA 的启动子上起动转录转录是不连续、分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon) 。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream) 的调控序列。调控序列中的启动子是RNA 聚合酶结合模板DNA 的部位，也是控制转录的关键部位。原核生物以RNA 聚合酶全酶结合到DNA 的启动子上而起动转录，其中由σ亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。对启动子的研究，常采用一种巧妙的方法即RNA 聚合酶保护法。E.coli 的转录起始和延长第一个磷酸二酯键生成后，σ亚基即从转录起始复合物上脱落，核心酶连同四磷酸二核苷酸，继续结合于DNA 模板上，酶沿DNA 链前移，进入延长阶段。依赖Rho 因子的转录终止非依赖Rho 因子的转录终止ρ因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量46kD 。ρ因子能结合RNA ，又以对poly C 的结合力最强。ρ因子还有ATP 酶活性和解螺旋酶(helicase) 的活性。目前认为，ρ因子终止转录的作用是：与RNA 转录产物结合，结合后ρ因子和RNA 聚合酶都可发生构象变化，从而使RNA 聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使DNA/RNA 杂化双链拆离，利于产物从转录复合物中释放。真核生物的转录过程比原核复杂。二者的转录起始过程有较大区别，转录终止也不相同。真核生物具有3种不同的RNA 聚合酶: 真核生物RNA 聚合酶的结构比原核生物复杂，所有真核生物的RNA 聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基. RNA 聚合酶Ⅱ由12 个亚基组成，其最大的亚基称为RBP1 。RNA 聚合酶Ⅱ最大亚基的羧基末端有一段共有序列(consensus sequence) 为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser 的重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminal domain, CTD) 。CTD 对于维持细胞的活性是必需的。二、转录起始需要启动子、RNA 聚合酶和转录因子的参与（一）转录起始前的上游区段具有启动子核心序列顺式作用元件包括启动子、启动子上游元件(upstream promoter elements) 或promoter-proximal elements) 等近端调控元件和增强子(enhancer) 等远隔序列。起始点上游多数有共同的TATA 序列，称为Hognest 盒或TATA 盒(TATA box) 。通常认为这就是启动子的核心序列。许多RNA 聚合酶II 识别的启动子具有保守的共有序列：位于转录起始点附近的起始子(intiator ，Inr) 。启动子上游元件是位于TATA 盒上游的DNA 序列，多在转录起始点约-40 ～-100nt 的位置，比较常见的是GC 盒和CAAT 盒。增强子是能够结合特异基因调节蛋白，促进邻近或远隔特定基因表达的DNA 序列。RNA 聚合酶II 与启动子的结合、启动转录需要多种蛋白质因子的协同作用。通常包括：可诱导因子或上游因子与增强子或启动子上游元件的结合；通用转录因子在启动子处的组装；辅激活因子和/或中介子在通用转录因子/RNA 聚合酶II 复合物与可诱导因子、上游因子之间的辅助和中介作用。因子和因子之间互相辨认、结合，以准确地控制基因是否转录、何时转录。（四）少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子。拼板理论(piecing theory) ：少数几个反式作用因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互相作用，再与基本转录因子、RNA 聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子、RNA 聚合酶结合，但有时也可直接与基本转录因子、RNA 聚合酶结合。真核生物转录生成的RNA 分子是初级RNA 转录物(primary RNA transcript) ，几乎所有的初级RNA 转录物都要经过加工，才能成为具有功能的成熟的RNA 。加工主要在细胞核中进行。帽子结构：帽子结构的意义：可以使mRNA 免遭核酸酶的攻击；也能与帽结合蛋白质复合体(cap-binding complex of protein) 结合，并参与mRNA 和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。poly A 的有无与长短，是维持mRNA 作为翻译模板的活性，以及增加mRNA 本身稳定性的因素。一般真核生物在胞浆内出现的mRNA ，其poly A 长度为100 至200 个核苷酸之间，也有少数例外。前体mRNA 分子的断裂和加多聚腺苷酸尾是多步骤过程。RNA 编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing) 。核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶。真核生物RNA 的加工Post-transcriptional Modification of Eukaryotic RNA 第四节几种主要的修饰方式：1. 剪接(splicing) 2. 剪切(cleavage) 3. 修饰(modification) 4. 添加(addition) 一、真核生物mRNA 的加工包括首、尾修饰和剪接（一）前体mRNA 在5’- 末端加入“帽”结构大多数真核mRNA 的5’- 末端有7- 甲基鸟嘌呤的帽结构。这个真核mRNA 加工过程的起始步骤由两种酶，加帽酶(capping enzyme) 和甲基转移酶(methyltransferase) 催化完成。5 pppGp…5 GpppGp…pppG ppi 鸟苷酸转移酶5 m7GpppGp…甲基转移酶SAM 帽子结构的生成过程：5 ppGp…磷酸酶Pi （二）前体mRNA 在3’端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾1. hnRNA 和snRNA 核内的初级mRNA 称为杂化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA) snRNA (small nuclear RNA) 核内的蛋白质小分子核糖核酸蛋白体（并接体, splicesome ）snRNA AAUAAA G/U 5’3’Poly(A) 信号Poly(A) 位点mRNA CPSF G/U 5’3’CPSF CFI,CFII,CStF CPSF CStF CFI CFII PAP CPSF CStF CFI CFII PAP ATP G/U P PPi CFII CFI CStF 慢速多腺苷酸化PABⅡCPSF AAAAAAAAAAOH PAP ATP PPi PABⅡ快速多腺苷酸化CPSF AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA HOAAAAAAAAAA PAP CPSF AAAAAAAAAAOH PAP 真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。断裂基因(splite gene) C A B D 编码区A 、B、C、D 非编码区2. 外显子(exon) 和内含子(intron) 外显子：在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA 的核酸序列。内含子：隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。鸡卵清蛋白基因hnRNA 首、尾修饰hnRNA 剪接成熟的mRNA 鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰鸡卵清蛋白成熟mRNA 与DNA 杂交电镜图DNA mRNA 3. 内含子的分类根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类：I ：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的rRNA 基因；II ：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA ；III ：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA 基因有此类内含子；IV ：是tRNA 基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP 。4. mRNA 的剪接——除去hnRNA 中的内含子，将外显子连接。snRNP 与hnRNA 结合成为并接体①（一）依赖ρ因子的转录终止ρ因子：ρ因子的作用原理：（二）非依赖Rho 因子的转录终止DNA 模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA 后，RNA 产物形成特殊的结构来终止转录。5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3` 5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3` RNA 5 TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT... 3 DNA UUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3` 近终止区的转录产物形成发夹(hairpin) 结构是非依赖ρ因子终止的普遍现象。茎环结构使转录终止的机理：使RNA 聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA 产物释放。5′pppG 5 3 3 5 RNA-pol 真核生物的转录过程The Process of Transcription in Eukaryote 第三节一、真核生物有三种DNA 依赖性RNA 聚合酶RNA 聚合酶Ⅰ（RNA PolⅠ）RNA 聚合酶Ⅱ（RNA PolⅡ）RNA 聚合酶Ⅲ（RNA Pol Ⅲ）真核生物的RNA 聚合酶Kornberg 父子不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的DNA 序列，但这些序列都可统称为顺式作用元件(cis-acting element) 。一个典型的真核生物基因上游序列: 5’3’调控序列TATA 盒Inr YYAN YY T A -30 +1 TATAAA 转录起始点TATA 盒CAAT 盒GC 盒增强子顺式作用元件(cis-acting element) AATAAA 切离加尾转录终止点修饰点外显子翻译起始点内含子OCT-1 OCT-1 ：ATTTGCAT 八聚体真核生物RNA 聚合酶Ⅱ转录的基因及其转录起始上游序列（二）转录因子能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA 的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors) 。反式作用因子中，直接或间接结合RNA 聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF) 。参与RNA-polⅡ转录的TFⅡⅡ型基因中的四类转录因子时间和空间（组织）特异性地调控转录增强子等远隔调控序列如MyoD 、HIF-1 等可诱导因子协助基本转录因子，提高转录效率和专一性启动子上游元件SP1 、ATF 、CTF 等上游因子在可诱导因子和上游因子与基本转录因子、RNA 聚合酶结合中起联结和中介作用TAFs 和中介子辅激活因子转录起始定位；转录起始和延长TBP 结合TATA 盒TBP,TFⅡA,B,E,G,F 和H 基本组分功能结合序列具体组分转录因子（三）转录起始前复合物真核生物RNA-pol 不与DNA 分子直接结合