第十二章基因诊断Gene Diagnosis 第一节基因诊断的技术和方法（以遗传病诊断为例）一、基因诊断的概念与特点二、基因诊断的常用技术及应用举例1. Southern blot  的基本步骤：提取DNA→限制性内切酶消化DNA 以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离→变性处理→DNA 转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上DNA 片段杂交，分析杂交信号。Northern 印迹(Northern blot) 杂交用于RNA 的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA 进行定性和定量分析。Northern blot 的步骤：RNA 经变性凝胶电泳后，将其转移到固相支持物上，以便用杂交反应检测特定的mRNA 分子的含量与大小。斑点杂交(dot blot hybridization)  镰状红细胞贫血病基因诊断举例：正常的（N）的：5′-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3′突变的（M）的：5′-ACT CCT GTG GAG AAG TCT GC-3′镰状红细胞贫血患者基因组的ASO 杂交法检测正常的（N）的ASO 探针：5′-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3′突变的（M）的ASO 探针：5′-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3′Allele Specific Oligonucleotide （ASO ）寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。斑点杂交一对引物：正向和反向 限制了PCR 扩增的片段的范围2. PCR 在基因诊断中的应用荧光定量PCR 多重-PCR PCR-ASO AS-PCR PCR-SSCP PCR-RFLP PCR-ASO AS-PCR （allele specific PCR ）等位基因特异PCR ：根据引物3′端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物（三）单链构象多态性分析（Single-strand conformation polymorphism ，SSCP ）DNA 的突变造成DNA 片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同—单链构象多态性（Single strand conformation polymorphism ，SSCP ），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链得以分离。（四）限制性片段长度多态性分析Restriction Fragment LengthPolymorphism （RFLP ）PCR-RFLP 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一或数个多态性的限制性内切酶识别序列，在PCR 扩增后用该限制酶切割PCR 产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。（五）DNA 序列测定（DNA sequencing ）根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析（一）直接诊断途径1. 必要条件：被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系被检基因正常分子结构已被确定被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知（二）、间接诊断途径1、采用原因：致病基因未知或基因结构不确定致病突变机理不清致病位点不便检测RFLP 标记的连锁分析基因诊断的其它应用举例病例SOX9 基因HMG box 内发生单碱基置换突变R178L(G→T) ，如图2所示，左侧正常对照第225 位碱基为C，而该患儿为A 例：序列分析用于基因诊断研究表12-2 基因诊断中常用的分子生物学方法比较选择合适的片段突变引起核酸构象改变而有不同电泳结果SSCP 选择引物变异引起扩增产物不同PCR 选择合适的探针错配时杂交信号减弱或消失核酸分子杂交关键问题基本原理方法关键问题基本原理方法全序列比较差异DNA 测序选择合适的限制性内切酶基因变异改变酶切图谱RFLP 三、基因诊断技术路线与方法RFLP 2.  点突变的检测：（1）导致特异性限制性内切酶位点改变（2）无限制性酶切位点改变斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR 、PCR-SSCP 、PCR-ASO 、PCR 产物直接测序举例：β- 地贫的PCR-RE （直接诊断）PCR-RE 分析MaeI CAAG  CTAG 1 ：未酶解片段；2 ：βA /βA ；3 ：βA /βT ；4 ：βT /βT 注：由于54bp 、114bp 、72bp 片段及分子量标准中低于200bp 的片段太小，在0.8% 的琼脂糖凝胶中不易被观察到。P317 在DNA 序列上有较长一段序列的重新排布。包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等3.  基因重排的检测：核酸分子探针杂交与PCR 举例：地中海贫血的直接基因诊断基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。P290 练习α1 α2 αααα+ α+ α+ αα0 α+ α0 α0 α0 BamHI BamHI α2 α1 α2 10 kb 14 kb probe 举例：地中海贫血的直接基因诊断基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。P290 练习Southern blot 检测结果：αα/αααα/α- αα/- - α- /- -  - - / - - 正常缺1 缺2 缺3 缺4 14kb 10kb 举例：地中海贫血的直接基因诊断4.  基因表达异常的检测mRNA 的相对定量分析mRNA 的绝对定量分析mRNA 长度分析M ：50bp DNA 标准；1：LNCaP 阳性对照；2：BPH ；3：健康男性志愿者；4～10 为PCa ；11 为试剂空白。举例：前列腺癌标记基因DD3PCA3 表达相对定量检测2. 遗传标记DNA 多态性：指群体中的DNA 分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上DNA 核苷酸序列存在一定的差异或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系A a a a A A A A：某一未知基因B ：某一已知遗传标记B b b b B B B * 讲授：陈慧勇分子生物学研究中心基因诊断之父—简悦威1976 年加州大学华裔科学家Kan YW 用核酸分子杂交首次对一例α地中海贫血进行诊断。基因诊断第一节基因诊断的技术和方法第二节遗传病的基因诊断第三节传染病的基因诊断第四节肿瘤的基因诊断第五节基因诊断法医学上应用内容提要基因诊断：用分子生物学的理论和技术，从基因或基因的表达产物水平来检测特定基因存在状态或缺陷，以对疾病作出诊断的过程。遗传物质改变(诊断依据)：一是基因或表达产物水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高等；二是基因结构变化即突变，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活等。基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用的广泛性（一）核酸分子杂交Nucleic acid hybridization 是指两条互补的单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。用于DNA 的定性或定量检测将RNA 或DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量的研究。P322 P322 镰状红细胞贫血患者基因组的ASO 杂交法检测A B C A B C N-ASO M-ASO  反向斑点印迹杂交(reverse dot blot hybridization) 探针先固定于膜上。用一张含有多种特异性寡核苷酸探针的膜与待测目的基因杂交，经过一次杂交便可同时筛查出被检DNA 中的多种突变。举例：β- 地贫的反相斑点杂交分析P323 核酸分子杂交的流程制备样品制备探针杂交检测（二）聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction （PCR ） 模板引物Taq DNA 聚合酶dNTP Mg2+ 降温升温升温1. PCR 原理5/——5/ —3/ 3/—5/——5/ —3/ 3/—多重PCR 5/——5/ —3/ 3/—ASO1 ASO2 N H M P323 P323 N M M M N N N PCR-SSCP 分析原理示意正常人纯合突变杂合突变+ ﹣举例：PCR-SSCP 分析由于DNA 变异产生新的酶切位点或消除原有的酶切位点，导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或PCR 的方法进行检测。A B C D E F G －＋D E F B G C A GAATTC CTTAAG E F B G －＋C +D A EcoR Ⅰ限制性内切酶位点的变化镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析MstⅡ酶切位点（CCTNAGG ）5′3′正常基因1.15kb (CCT GAG G) × 5′3′突变基因1.35kb (CCT GTG G) 举例：+ ﹣0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人突变携带着患者镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析P322 举例：HBS 的PCR- 限制性内切酶谱分析正常人的扩增产物经Mst Ⅱ消化可生成54bp 和56bp 两个片段，而患者扩增的DNA 片段不被酶切，仍为110bp ，3为镰状细胞贫血症HbS 杂合体。P322 * * *