结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA 中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。www.book118.com 　结合物的保存酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP 结合物加硫柳泵，AP 结合物可加叠氮钠）。www.book118.com 　结合物的稀释液用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1% 牛血清白蛋白，0.05% 吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。试剂准备C 酶的底物3.3 　酶的底物www.book118.com 　HRP 的底物OPD 氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm 处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP 结合物最常用的底物。DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，DH2 为供氧体，H2O2 为受氢体。DH2 一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2 如：邻苯二胺(OPD) 、四甲基联苯胺(TMB) 和ABTS 。E TMB 经HRP 作用后共产物显蓝色。TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2 溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB 产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm 。ABTS 虽不如OPD 和TMB 敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。HRP 对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2 、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide) 。AP 的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm 波长处有吸收峰。用NaOH 终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP 也有发荧光底物（磷酸4- 甲基伞酮），可用于ELISA 作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。3.5 　酶反应终止液　　常用的HRP 反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA 中一般采用2mol/L 。4 对照设定阳性对照品(positive control) 和阴性对照品(negative control) 是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。 加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。　参考标准品定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5 个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中. 	阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg 检测的阴性对照品中不可含HBsAg ，最好抗HBs 也是阴性。原理类型试剂准备对照标本结果* ELISA 知识简介09/12/25 1. 　ELISA 的原理2. 　ELISA 的类型3. 　试剂准备：免疫吸附剂结合物酶底物的准备4. 　对照设定5. 　标本的采取和保存6. 　结果判断ELISA 是一种免疫测定（immunoassay ，IA ）。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。1. 　ELISA 的原理酶免疫测定类型这种固相酶免疫测定方法在1971 年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ），简称ELISA 。酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定1.1 　抗原抗体反应www.book118.com 　可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab 　抗体的亲和力（affinity ），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab] ／[Ag][Ab] ,Ag·Ab 的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。www.book118.com 　特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。 www.book118.com 　最适比例www.book118.com 　敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml 水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml 水平例如，HBsAg ，其敏感度可达0.1ng/ml 。1.4 　免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。2　ELISA 的类型ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent ）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate ）；（3）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。www.book118.com 　双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg 、AFP 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。www.book118.com 双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。www.book118.com 间接法测抗体传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。www.book118.com 竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。www.book118.com 竞争法测抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA 测定多用此法。 www.book118.com 捕获包被法测抗体IgM 的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM 抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM （其中包括针对抗原的特异性IgM 抗体和非特异性的IgM ）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。www.book118.com ABS-ELISA 法①：固相支持物；②：样品；③：特异性IgG ；④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin ）；⑤：辣根过氧化物酶HRP- 酶标链亲和素（Avidin ）；⑥：DAB 显色液；⑦：显色；3. ELISA 的试剂(A 、B、C三部分) ELISA 中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液ELISA 的试剂准备A 固相载体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA 板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。www.book118.com 　包被的方式将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating) 。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA ，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA 板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10 乃至于/100 。包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。www.book118.com 　包被用抗体IgG 对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc 段上，抗体结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA ，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。www.book118.com 　包被的条件		pH9.6 碳酸盐缓冲液		pH7.2 的磷酸盐缓冲液		pH7-8 的Tris-HCL 缓冲液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml 。www.book118.com 　封闭封闭(blocking) 是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA 后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5% 的BSA; 10% 的小牛血清或1% 明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5% ）。所有的ELISA 固相均需封闭？3.4 　洗涤液　　在板式ELISA 中，常用的稀释液为含0.05% 吐温20 磷酸盐缓冲液。　ELISA 的试剂准备B 3.2 　结合物即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA 中关键的试剂1 酶的催化活性2 抗体（或抗原）的免疫活性3 含有或少含有游