第五章蛋白质的定性定量检测第一节免疫组织化学的基本理论第二节蛋白质的定量检测第三节免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量第四节酶联免疫吸附试验（ELISA ）第一节免疫组织化学的基本理论一、形态学研究的方法（S）二、组织化学三、免疫组织化学一、形态学研究的方法（S）（一）普通光镜术（二）特殊光镜术1. 荧光显微镜2. 相差显微镜3. 暗视野显微镜4. 激光扫描共聚焦显微镜（三）电镜术1. 透射电镜术2. 扫描电镜术3. 冷冻蚀刻术二、组织化学（histochemistry ）组织化学（histochemistry ）：以组织学为基础，应用物理和化学的技术方法显示细胞组织结构中的各种化学成分，并对这些物质进行定位、定性和定量，从而分析研究生物体在生理或病理状态下细胞和组织代谢、功能及形态变化规律的科学。细胞化学技术（S）细胞化学技术能够对细胞内的各种成分进行定性、定位、定量研究，包括悬浮胸腹水细胞、血液细胞以及体外培养细胞均能产生同样良好的效果。目前，用细胞化学技术所能显示的化学成分有蛋白质（显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基）、RNA 、DNA 、糖类（如糖原、粘多糖和糖脂等）、脂类（如中性脂肪、磷脂和固醇等）、酶（如磷酸酶）、特异抗原（其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等）、无机盐和微量元素（如铁、铜、锌、镁等）。原理：细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反应产物。常见的有：1. 孚尔根反应法（Feulgen reaction ）：显示DNA 呈现紫红色。2. 甲绿-派郎宁法（Methyl Green-Pyronin method ）：显示核酸（甲绿染DNA 呈现绿色，派郎宁染RNA 呈现红色）。3. 苏丹Ⅲ冰冻切片染色：显示中性脂肪呈现橘红色。4. 普鲁士蓝反应：显示组织中含铁血黄素。5. 过碘酸雪夫反应（Periodic acid schiff reaction ，PAS ）：显示糖原和其它多糖物质为紫红色。三、免疫组织化学（immunohistochemistry ）（一）免疫组织化学的概念（二）免疫组织化学的简要步骤1. 抗体（anbibody ，Ab ）的制备（1）抗原的提取和纯化（2）免疫动物制备多克隆抗体或细胞融合制备单克隆抗体（3）抗体效价检测和纯化（4）标记复合物的制备2. 抗原（antigen ，Ag ）的检测（1）细胞或组织切片的制备（2）免疫组织化学反应和显色3. 结果观察和记录（三）抗原-抗体反应抗原-抗体反应：由抗原物质刺激机体产生相应的特异性抗体后，抗原和其特异性的抗体在体内或体外发生结合反应的过程。利用抗原、抗体在体外可以发生特异性结合反应的特点，将其应用到细胞组织化学中，可对各种抗原或生物活性物质进行分离及检测。（四）免疫标记化学反应与检测免疫标记化学反应：用荧光素等发光剂、酶等呈色物或放射性核素等作为示踪物标记抗体分子，在适宜的条件下（即适宜的温度和pH 等），标记抗体与抗原发生特异性的反应。常用标记物1. 荧光素（1）异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate ，FITC ）：绿色荧光；（2）四乙基罗达明：橙红色荧光；（3）四甲基异硫氰酸罗达明：橙红色荧光；（4）藻红蛋白：红色荧光2. 酶（1）辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase ，HRP ）；（2）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ，AP ）3. 金属标记物：如胶体金，多用于免疫电镜。4. 放射性核素：涉及污染，防护难，一般不用。检测酶等呈色物与一定的底物结合后，可以形成具有特殊颜色的化合物，即可知道呈色物标记的抗体与相应的抗原形成的复合物的存在情况。荧光物质可以在高压汞灯的激发下，发出特定颜色的荧光，可以在荧光显微镜下被观察到。胶体金颗粒可以在透射电子显微镜（transmission electron microscope ，TEM ）下观察。放射性同位素可以使胶片感光，经放射自显影后就可以知道标记抗体与抗原反应的情况。（五）常用免疫组织化学染色方法1. 直接法2. 间接法3. PAP 法4. APAAP 法5. ABC 法6. SABC 法7. LSAB 法8. SP 法9. SAP 法1. 直接法2. 间接法先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异性抗体，二抗仅有种族特异性。特点：（1）较直接法灵敏。（2）可标记一种抗体，检测多种抗原。3. 过氧化物酶-抗过氧化物酶法（Peroxidase anti-peroxidase method ，PAP ）先将过氧化物酶（HRP ）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗HRP 抗体；然后再与HRP 结合，形成PAP 复合物。特点：（1）敏感性较高；（2）背景染色低（相对）；（3）所染标本可长期保存。PAP 的原理示意图4. 碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法（alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase method ，APAAP 法）美籍华人Hsu 于1981 年首次报道。该法以卵白素作为桥，把生物素化的抗体（二抗）与生物素结合酶（如HRP 标记的生物素）连接起来。生物素（biotin ）/维生素H（S）亲和素和链霉亲和素（S）亲和素（avidin ）/卵白素/抗生物素蛋白：碱性糖蛋白，分子量68 kDa ，由4个相同的亚基组成，每个亚基可以与一分子生物素结合。它对生物素的亲和力很强，比抗原抗体的结合力高1万倍以上。链霉亲和素（streptavidin ，SA ）/链霉卵白素：链霉菌培养过程中的分泌产物，是一种非糖基化的酸性蛋白。它是一个四聚体蛋白，提供4个生物素结合位点。SA 特异性更高，而且可以耐受较高的盐浓度（如2 mol/L KCl ）和较强的变性剂（如1% SDS ）。ABC 复合物的制备ABC 法的优点（1）灵敏度较PAP 法提高20~40 倍。（2）一抗和二抗可高度稀释，使背景染色下降。6. SABC 法（Streptavidin Biotin-peroxidase Complex ）：将ABC 复合物中的卵白素换成链霉亲和素。7. LSAB 法（labelled Streptavidin-Biotin ）：将链霉亲和素和生物素先连结起来。8. SP 法（Streptavidin Peroxidase conjugataed method ）：将链霉卵白素和辣根过氧化物酶直接偶联在一起。9. SAP 法（streptavidin alkaline phosphatase conjugataed method ）：将链霉卵白素和碱性磷酸酶直接偶联在一起。（六）免疫组化在临床病理诊断中的应用（S）标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度协助肿瘤良恶性的诊断鉴别低分化癌和肉瘤鉴别转移癌的性质协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶鉴别小细胞恶性肿瘤癌组织耐药基因的检测为癌症患者治疗方案的拟定提供依据确定肿瘤组织的增殖活性评估癌症患者的预后检测病原体第二节蛋白质的定量检测一、凯氏定氮法二、双缩脲法三、Folin- 酚试剂法（Lowry 法）四、紫外分光光度法五、考马斯亮蓝G-250 染色法六、BCA 法一、凯氏定氮法1983 年由丹麦化学家凯道尔建立，以后经过改良使其更符合蛋白质定量的要求。理论基础：各种蛋白质的含氮量很接近，通常占其总重量的16 ％左右。蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变为硫酸铵，硫酸铵中的NH4+ 与NaOH 反应又可转变为NH3 ，用硼酸液吸收后，可由标准盐酸滴定并定量。由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量。蛋白质含量＝含氮量Х6.25 此方法的测定范围为0.2 ～1.0 mg 氮。二、双缩脲法原理：蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2 ）反应。在碱性条件下，肽键的质子被解离，Cu2+ 和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物，在540 ～560 nm 的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。双缩脲法的具体操作参见P144~145“双缩脲法测定蛋白质浓度”。显色反应仅与肽键数呈正比关系，与蛋白质的种类、分子质量及氨基酸组成无明显关系。Cu2+ 与氨基酸（Arg 除外）和二肽均不发生反应，仅和1- 亚氨基缩脲、2- 亚氨基缩脲、丙二酰胺等少数几种物质有呈色反应。基本上可以认为双缩脲反应是蛋白质特有的反应。三、Folin- 酚试剂法/Lowry 法（P145~146 ）1951 年由Lowery 建立，是目前应用较广泛、灵敏地测定蛋白质含量的方法之一。原理：蛋白质在碱性条件下与试剂甲（双缩脲试剂）中的Cu2+ 形成络合物。由于蛋白质含芳香族氨基酸残基（如Tyr 和Trp ），生成的络合物可还原试剂乙（Folin- 酚试剂）中的磷钼酸和磷钨酸而产生钼蓝和钨蓝复合物，该复合物显蓝色，其颜色深浅与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于定量分析。Folin- 酚试剂法注意事项Folin- 酚试剂只在酸性溶液中稳定，但本实验在pH10 条件下发生，因而加入Folin- 酚试剂后立即混匀，使Folin- 酚试剂在被破坏之前就发生反应。Folin- 酚试剂法的优点和缺点优点：此法较双缩脲法灵敏。缺点：较费时。（P54 ）标准曲线的直线不太好。（P54 ）此法干扰物质较多。例如琥珀酸缓冲液、Tris 缓冲液；螯合剂（EDTA 等）；糖类（葡萄糖、蔗糖等）；还原剂（酚、β- 巯基乙醇等）、去垢剂（Triton 等）；尿素；硫酸铵；三氯乙酸等。四、紫外分光光度法由于蛋白质中的Tyr 、Trp 和Phe 残基含有共轭双键，蛋白质溶液在275 ～280 nm 处有一紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质的A280 与其浓度呈正比，据此可进行蛋白质定量测定。五、考马斯亮蓝G-250 染色法/Bradford 法1976 年由Bradford 建立。原理：考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中以游离态存在时呈棕红色，它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色。色素对可见光谱的最大吸收值从465 nm 转移到595 nm 处。蛋白质与色素的结合反应很快速，约在2 min 左右的时间内达到平衡，在室温1 h 之内是稳定的。在0.01 ～1.0 mg 蛋白质/mL 范围内，蛋白质含量与OD595 值呈正比。考马斯亮蓝G-250 染色法的具体操作参见P146~147“Bradford 检测法”。六、BCA 法原理：BCA （bicinchoninic acid ）是对一价铜离子（Cu+ ）敏感、稳定和高特异性的试剂。在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+ 还原成Cu+ ，后者与测定试剂中BCA 形成一个在562 nm 处具有最大光吸收的紫色复合物。复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。BCA 法原理示意图第三节免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量一、免疫印迹/Western blot 的概念二、免疫印迹法检测样品中特异蛋白质的基本流程三、Western blot 的常用缓冲液配置四、Western blot 的操作步骤五、注意的问题一、免疫印迹/Western blot 的概念Western blot/ 免疫印迹：蛋白样品经过电泳分离后，转移并固定于膜上，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一种细胞在不同条件下的相对含量的半定