病理学常用技术的原理及应用第一节大体与组织病理学技术第二节组织化学与免疫组织化学（二）免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一种技术，有较高的敏感性和特异性，能将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片、细胞涂片、培养细胞爬片上定位某些蛋白质或多肽类物质，结合计算机图像分析技术或激光扫描共聚显微术等，对被检物质进行定量分析。1、免疫组织化学染色方法按标记物性质分：荧光法、酶法、免疫金、银及铁标记技术等。按染色步骤分：直接法、间接法。按结合方式分：抗原-抗体结合法、亲和连接法、标记的链亲和素-生物素法等。2、免疫组化染色的质量控制和结果阳性表达方式：（1）胞浆阳性（2）核周胞浆阳性（3）胞浆局限性点状阳性（4）细胞膜阳性（5）细胞核阳性影响免疫组化染色质量的因素：取材及固定抗体质量抗原封闭和修复技术操作3、免疫组化的应用大量商品化的单克隆和多克隆抗体出现、配套试剂盒的使用及方法学的不断完善，使免疫组织化学染色已经成为医学基础研究和病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。免疫组化技术可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测、细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。免疫组织化学染色技术也是非放射性原位杂交、原位PCR 和原位末端标记DNA 片段等技术的基础。第三节电子显微镜技术透射电子显微镜是最早、最广泛应用于医学领域的一种电镜，以后又相继诞生了扫描电镜、超高压电镜等。电镜的使用大大地开阔了我们的视野，看清了细胞膜和细胞浆内的各种细胞器和细胞核的细微结构及其病理变化，并由此产生了亚细胞结构病理学，又称超微结构病理学。电镜技术的应用在生命科学领域可用于胚胎及组织发生学方面的研究和观察；在临床上可用于多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断，特别是肾小球疾病及肌病的诊断，以及一些疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定，如一些去分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断；最早关于细胞凋亡的形态学描述也是源于电镜的观察。第四节原位多聚酶链式反应技术原位多聚酶链式反应技术是多聚酶链式反应( polymerase chain reaction，PCR) 技术的一部分，是在体外经酶促反应将某一特定DNA 序列进行高效、快速扩增，它可将单一拷贝或低拷贝的待测核酸以指数的形式扩增而达到常规方法可检测的水平。原位PCR(in situ PCR) 技术是将PCR 的高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合，在冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上来检测和定位核酸的技术。原位PCR 技术方法原位PCR 技术有直接法原位PCR、间接法原位PCR、原位反转录PCR 和原位再生式序列复制反应等方法，其中应用相对较广泛的是间接原位PCR 方法。主要程序有组织固定、预处理(如蛋白酶K 和RNA 酶消化)、原位扩增及扩增产物的原位杂交和检测等。由于使用原位杂交技术对扩增产物作检测，使该方法的特异性较直接法高。原位PCR 技术的应用及存在的问题应用：原位PCR 技术能用于低拷贝的内源性基因的检测和定位，可用于基因突变、基因重排和染色体易位等的研究和观察；还可用于外源性基因的检测和定位，如对各种感染性疾病病原的基因检测，如EB 病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒基因组及结核、麻风杆菌基因的检测等；在临床上还可用于对接受了基因治疗患者体内导人基因的检测等。存在的问题：①特异性不高，特别是假阳性的问题。产生的原因有引物与模板的错配、在扩增中因细胞内受损伤DNA 的修复而形成的非特异性序列和特异性扩增序列的弥散等。②技术操作复杂，影响因素太多。③需要特殊的设备，即原位PCR 仪，价格昂贵。第五节核酸原位杂交原位杂交是核酸分子杂交的一部分，是将组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。用标记了的已知序列的核苷酸片段作为探针，通过杂交直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位某一特定的靶DNA 或RNA 的存在。其生物化学基础是DNA 变性、复性和碱基互补配对结合。根据所选用的探针和待检靶序列的不同，有DNA-DNA 杂交、DNA-RNA 杂交和RNA-RNA 杂交。探针的选择和标记用于原位杂交的探针有双链cDNA 探针、单链cDNA 探针、单链cRNA 探针和合成的寡核苷酸探针等。探针的长度以50-300个碱基为宜，用于染色体原位杂交的探针可为1.2～1.5 kb。探针标记物有放射性同位素如3 H、35S、32p 等，这类探针的敏感性高；非放射性探针标记物有荧光素、地高辛和生物素等，其敏感性不如放射性标记探针，但有性能稳定、操作简便、成本低和耗时短等优点。原位杂交的主要程序实验材料：常规石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、细胞涂片和培养细胞爬片等。主要程序：包括杂交前准备、预处理、杂交、杂交后处理-清洗和杂交体的检测等。应注意的问题：①DNA-RNA 杂交和RNA-RNA 杂交，需灭活RNA 酶处理；使用双链cDNA 探针和/或待测靶序列是DNA 时，需进行变性处理使DNA 解链；②杂交温度应低于杂交体的解链温度( Tm)25 度左右；③对照实验：有组织对照、探针对照、杂交反应体系对照和检测系统的对照等，根据具体情况选用。荧光原位杂交可以用直接法或间接法进行，直接法以荧光素直接标记已知DNA 探针，间接法以非荧光标记物标记已知DNA 探针，再桥连一个荧光标记的抗体。本法是一种DNA-DNA 杂交，实验材料可以是间期细胞、分裂中期的染色体，也可以是冰冻或石蜡切片等。探针有不同的类型，如重复序列探针、位点特异性探针和全染色体探针等，目前已有大量商品化的荧光标记探针。原位杂交技术的应用原位杂交可应用于：①细胞特异性mRNA 转录的定位可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；②感染组织中病毒DNA／RNA 的检测和定位；③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；④基因在染色体上的定位；⑤检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等；⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。第六节显微切割术 显微切割术是90年代初发展起来的一门新技术，能够从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，甚至单个细胞，再进行有关的分子生物学方面的研究，如PCR，PCR-SSCP 及比较基因组杂交等。材料：冰冻或石蜡包埋组织切片或细胞涂片。切片的厚度为4-10 um，冰冻切片需经甲醛或乙醇固定。用于显微切割的组织切片必须染色，以便于进行目标细胞群或单一细胞的定位。操作方法：有手工操作法和激光显微切割法。激光捕获显微切割技术的基本原理是：将组织切片放在倒置显微镜的载物台上，激光束从切片的上方垂直照射下来，落在要切割的区域。该区的乙烯乙酸乙烯酯膜受激光照射后，瞬间温度升高并与其下方的细胞相粘连；当将膜揭起来时，与之相连的细胞也随之被完好地从切片上切割下来；将带有细胞的膜放入试管内经蛋白酶消化使细胞与膜分开，同时也将细胞裂解，获得待提物质，如DNA、RNA 或蛋白质等。意义：可从构成复杂的组织中获得某一特定的同类细胞或单个细胞，适用于肿瘤的分子生物学研究，如肿瘤的克隆性分析、肿瘤发生和演进过程中各阶段细胞基因改变的比较研究和肿瘤细胞内某些酶活性的定量检测等。不足之处是技术难度大；需特殊的设备，激光器造价高。第七节生物芯片技术(一)基因芯片基因芯片又称DNA 芯片( DNA chip)，是指固着在固相载体上的高密度的DNA 微点阵。就是将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地排列在如硅片、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上，这就是基因芯片。一套完整的基因芯片分析系统包括芯片阵列仪、激光扫描仪、计算机及生物信息软件处理系统等。基因芯片的分类和工作原理按基因芯片的功能分：表达谱基因芯片、诊断芯片和检测芯片，前者主要用于基因功能的研究；后两者可用于遗传病、代谢病和某些肿瘤的诊断或病原微生物的检测等。表达谱基因芯片检测的基本原理：用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组织的mRNA 分别标记制成探针，将探针混合后与芯片上的DNA 片段进行杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片，再通过计算机分析出这些基因在不同组织中表达差异的重要信息。基因芯片的应用：基础研究方面有基因表达谱分析、基因分型、基因突变的检测、新基因的寻找、遗传作图和重测序等；临床上可用于抗生素和抗肿瘤药物的筛选和疾病的诊断等方面。利用基因芯片可以大规模、高通量地对成千上万个基因同时进行研究，从而解决了传统的核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、操作序列数量少和检测效率低等问题。实验材料是从新鲜组织或培养细胞中提取的mRNA，对外周血或培养细胞样本的研究相对容易，对实体瘤的研究受到限制。蛋白质芯片蛋白质芯片是继基因芯片之后发展起来的对基因功能产物表达水平检测的技术。也是在一个载体上点布高密度不同种类的蛋白质，再用荧光标记的已知抗体或配体与待测样本中的抗体或配体一起同芯片上蛋白质竞争结合，在扫描仪上读出荧光强弱，再经计算机分析计算出待测样本结果。检测容量已达一万三千多个点，并实现了整个过程全自动化检测，具有高效率、低成本的特点，尤其适合于蛋白表达的大规模、多种类筛查，并能用于受体—配体、多种感染因素的筛查和肿瘤的诊断。组织芯片组织芯片是将数十个至数百个小的组织片整齐地排列在某一载体上(通常是载玻片)而成的微缩组织切片。制作流程主要包括组织筛选和定位、阵列蜡块的制作和切片等步骤。组织芯片的特点是体积小、信息含量大，并可根据不同的需求进行组合并制成各种组织芯片，能高效、快速和低消耗地进行各种原位组织学的研究和观察，如形态组织芯片制作流程学、免疫组织化学、原位杂交和原位PCR 等。在科研工作中可单独或与基因芯片配套用于基因及其蛋白表达产物的分析和基因功能的研究；还可作为组织学和病理学实习教材、外科病理微缩图谱。*  大体观察—主要运用肉眼或辅以放大镜、量尺和磅秤等工具，对大体标本及其病变性状进行细致的观察和检测。组织和细胞学观察—将病变组织制成切片染色，或脱落、穿刺细胞涂片染色，显微镜观察。（一）组织化学一般称特殊染色，通过应用某些组织化学成分特异性结合的显色试剂，显示病变组织细胞的化学成分(如蛋白质、酶类、核酸、糖类、脂类等），从而加深对形态结构和代谢改变的认识，弄清形态改变与代谢改变的关系。如过碘酸Schiff 反应（PAS）或区别骨Ewing 肉瘤和淋巴瘤，前者胞浆内含有糖原呈阳性，后者阴性，磷钨酸苏木精染色可显示横纹肌肉瘤中瘤细胞胞浆中的横纹。肌动蛋白雄激素受体CD3-T 细胞雌激素受体（ER）随着电镜技术的不断发展，以及与其他方法的综合使用，还出现了免疫电镜、电镜细胞化学技术、电镜图像分析技术及全息显微术等。电镜技术也有其局限性，如电镜设备昂贵、样本制备较复杂、实验费用较高；另外，由于样本取材少，观察范围有限，有时还可能会遗漏信息；当用于辅助肿瘤外检诊断时，只能判定组织或细胞的来源，不能确定肿瘤的良恶性。*