动物细胞培养技术主讲人:HUBEIXIONGYAO 动物细胞培养技术1 . 固定化动物细胞大规模培养技术2. 动物细胞的灌注养方法3. 动物细胞无血清培养技术4. 动物细胞培养生物反应器一. 前言动物细胞培养开始于本世纪初1962 年, 其规模开始扩大, 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法, 利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等, 已成为医药生物高技术产业的重要部分。利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50% 。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。目前, 动物细胞有悬浮培养和贴壁培养.技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。一. 固定化动物细胞大规模培养技术1. 　固定化培养方法在动物细胞培养中, 培养细胞的目的不仅仅要求催化活细胞培养中, 培养细胞的目的不仅仅要求催化活力, 更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白, 因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性, 上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性, 另外多糖(如卡拉胶等) 由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法, 如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。二．动物细胞的灌注养方法动物细胞培养同传统的微生物细胞培养相比, 动物细胞培养存在着细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对营养的要求高、对外界环境如温度、pH 、溶氧、渗透压、剪切力的敏感性强、细胞状态容易改变等问题, 大大增加了动物细胞培养的难度。如何完善细胞培养技术, 提高动物细胞大规模培养的产率, 一直是国内外研究的热点之一。三. 动物细胞无血清培养技术动物细胞无血清培养是生物科学领域中的重要研究课题之一。由于无血清培养基可以是完全采用已知分子结构和构型组分的低蛋白或无蛋白培养基。因而它不仅为研究和阐明细胞生长、增殖和分化的调节机制提供了有力的工具，而且为现代生物技术，尤其是细胞工程的应用准备了更好的条件。下面就动物细胞无血清培养基及其应用现状做一概述。1 动物细胞培养基的发展过程：（1）天然培养基阶段（2）合成培养基阶段（3）无血清培养阶段四. 动物细胞培养生物反应器细胞培养生物反应器是整个过程的关键设备,它要为细胞提供适宜的生长环境并决定着细胞培养的质量和产量。按照动物细胞的生长要求, 具备低的剪切效应、较好的传递效果和流体力学性质是这类反应器设计或改进所必须遵循的原则。五　其它方法：改变细胞特性在大规模动物细胞培养的初期, 细胞数量不断增加, 表达重组蛋白的能力也在逐步提高L细胞表达随细胞数量达到顶峰之后, 细胞数量和表达水平将下降L 因为用于生产具有重要医用作用的生物活性蛋白的工程细胞, 其基因组普遍整合了病毒载体, 这就从根本上决定了细胞最终命运是细胞凋亡L 目前已知参与细胞凋亡调控基因包括c2m yc 、c2jun 、bcl22 、c2fo s 、ras 、p 53 、bcl2x 、bax 等,有些促进细胞凋亡, 有些抑制细胞凋亡L将抑制细胞凋亡的bcl22 基因导入细胞, bcl22 基因的过量表达可抑制Gln 或缺氧引起的细胞凋亡, 减少细胞特定营养成分的消耗, 提高细胞密度和目的蛋白产量L已证实bcl22 基因的过度表达可以提高灌流培养中杂交瘤细胞的活性和抗体的生产率. 六　结　语一项新的细胞培养技术的发展成熟需要较长的时间。大规模培养动物细胞是一项复杂而且经验性很强的工作L严格控制细胞培养的环境, 防止污染, 是进行大规模培养的前提L通过减少培养基中各种不利因素, 配置细胞生长的专一性无血清培养基, 以及选择条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器和最适合细胞生长的微载体,可提高细胞的活性和表达水平感谢: 各位的光临! 2. 1 　阶段培养一般认为, 动物细胞的培养条件应尽量模拟来源动物体内的条件, 而且在培养中通常保持不变。而实际上, 每种细胞的最适生长条件和最适产物生成条件是不同的。阶段法培养就是根据这一点, 把培养过程分为细胞生长期和产物生成期, 分别采取不同的培养条件, 以达到在细胞生长期使接种细胞大量繁殖, 提高比生长速率, 尽快获得高密度细胞; 在产物生成期保持细的高密度, 维持存活率, 降低细胞死亡速率, 持续获得高产率蛋白的目的。当产物蛋白对细胞有抑制时, 阶段培养尤见优势。具体说来, 可以用以下方法。2. 1 　阶段培养一般认为, 动物细胞的培养条件应尽量模拟来源动物体内的条件, 而且在培养中通常保持不变。而实际上, 每种细胞的最适生长条件和最适产物生成条件是不同的。阶段法培养就是根据这一点, 把培养过程分为细胞生长期和产物生成期, 分别采取不同的培养条件, 以达到在细胞生长期使接种细胞大量繁殖, 提高比生长速率, 尽快获得高密度细胞; 在产物生成期保持细的高密度, 维持存活率, 降低细胞死亡速率, 持续获得高产率蛋白的目的。当产物蛋白对细胞有抑制时, 阶段培养尤见优势。具体说来, 可以用以下方法。2. 1. 2 　pH 值阶段培养对大多数动物细胞, 培养液中合适的pH 为7. 2—7. 4 。低于6. 8 或高于7. 6 对细胞的生长都不利。近年来, 对胞内pH 的研究比较活跃。实验发现胞内pH 对细胞的代谢影响很大, 胞内pH 降低0. 2 个单位, 就足以使磷酸果糖激酶失活, 抑制糖酵解途径, 使细胞的生长受阻; 而胞内pH 升高0. 2 个单位,可以提高糖酵解速度50% 。胞外pH 的降低和培养液中铵离子浓度的提高, 都能引起胞浆酸化, 胞内pH 降低。有人把CO 2 的浓度由5% 降为2. 5% , 胞内pH 提高了0. 2 个单位。胞内pH 比胞外pH 的检测麻烦, 所以还没有广泛应用。2. 1. 3 　溶氧阶段培养不同细胞和同一细胞在不同生长时期对氧的需求均不相同.有人发现细胞生长的最适溶氧值为60% , 但有人发现杂交瘤的最适溶氧为100% 。一般说来, 溶氧主要影响细胞的繁殖, 而对产物的生成无直接影响, 通过影响细胞生长间接起作用。通常在细胞生长初期控制溶氧的较低的水平, 在对数生长期, 当细胞达到较高的浓度时, 提高溶氧水平; 在产物生成期, 应控制溶氧的适当水平。溶氧过高, 细胞就会加速消耗营养物质, 产生许多代谢产物。这些代谢产物对细胞有抑制作用, 会大大降低细胞的存活率, 降低产物的比生成速率。溶氧过低, 细胞过氧的需求得不到满足, 依然会降低产物蛋白的产率。2. 1. 4 　化学试剂诱导阶段培养如果构建的细胞上有可诱导基因, 进入产物生成期后, 就可以添加化学试剂对基因进行诱导, 以实现目的基因的高表达, 比如,将表达尿激酶原和二氢叶酸还原酶基因的两个转录单位置于同一载体, 分别受金属硫(M T ) 和SV 40 早期启动子控制, 具有用氨甲喋呤(M TX) 使基因扩增和利用金属Zn2+ 诱导的双重功能, 有利于尿激酶的高表达。细胞在细胞周期的不同时期, 不仅蛋白的分泌速率不同, 而且所分泌蛋白的类型和糖基化程度也可能不同。因此, 研究并控制细胞的生理状态很重要。然而, 在细胞培养中, 细胞生理状态的检测很麻烦。有人发现,细胞大小随各时期变化很明显, 因此可以作电子细胞计数器就行了。分段培养应结合具体的培养条件进行。有些细胞的最适生长温度和产物生成温度相同, 就不能进行温度阶段培养, 而应寻找别的差异条件。在细胞生长期有的细胞可能会因比生长速率过大而产生非生产性细胞, 这时就应控制比生长速率在一个适当的范围。3　代谢调控培养乳酸和氨是在培养过程中动物细胞产生的主要代谢产物, 对细胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。在分批培养和补料分批培养中的这一问题尤为突出。尽管灌注培养可以通过提高灌注速度来去除抑制产物。但是, 一方面由于灌注培养细胞浓度很高, 提高灌注速率, 营养成分的供给十分充分, 氨和乳酸的产生速率也增加了。另一方面, 过高的灌注速率提高了细胞的比生长速率, 降低产物的比产率, 加上细胞对营养的利用并不彻底, 培养液中会残留大量的蛋白, 造成提取纯化的不便和培养基的浪费。所以, 在培养中调控动物细胞的代谢途径一直较受重视。通过代谢调控, 可以减少副产物的产生, 降低细胞的死亡速率, 还可以控制灌注速率和培养液成分, 控制细胞的状态和比生长速率, 以提高目标蛋白的产率。具体有以下方法。3. 1 　控制葡萄糖浓度法乳酸浓度升高,会导致比生长速率降低, 比死亡速率升高。乳酸的降低可更换葡萄糖为己糖如果糖或半乳糖, 还可限制葡萄糖减少乳酸的生成, 使初始葡萄糖浓度较低, 在培养过程中再添加。在控制葡萄糖浓度法培养中, 生长期可以使葡萄糖浓度稍高, 以促进细胞生长; 在产物合成期降低葡萄糖的浓度, 降低乳酸的产生速率, 避免乳酸的积累, 减少毒害, 降低死亡速率, 维护持活细胞数在较高水平。同时还可以降低比生长速率, 增加目标蛋白的产生速率。灌注葡萄糖的同时, 要间歇或连续地加入其他组分, 以避免营养缺乏, 其中谷氨酰胺要保持在较低水平, 因为细胞的生长不依赖糖酵解, 即使没有葡萄糖, 细胞仍可以通过降解谷氨酰胺获得能量。假如谷氨酰胺的浓度过高, 细胞就会偏向谷氨酰胺酵解, 从而削弱这种方法的效果。由于葡萄糖的价格相对低廉, 这种方法很有前途。3. 2 　控制谷氨酰胺法上面提到, 没有葡萄糖, 细胞可以利用谷氨酰胺作能量物质。因此, 控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些, 应用这一方法的报道也较多。控制谷氨酰胺浓度的目的, 主要是减少氨的产生。氨对细胞的毒性比乳酸大得多, 表现为降低比生长速率, 增加死亡速率。有人详细地研究了动物细胞的代谢过程, 采用底物限制补料分批工艺对动物细胞进行代谢控制。他采用这一方法, 使氨的浓度降低了一半。控制谷氨酰胺法与控制葡萄糖法一样, 要维持葡萄糖在较低水平。3. 3 　控制葡萄糖和谷氨酰胺法在细胞中, 葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切相关。葡萄糖消耗上升, 则谷氨酰胺消耗下降, 反之亦然。在相当大的一个范围内, 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率与其浓度成正比。控制葡萄糖和谷氨酰胺法可降低乳酸和氨的产生, 还能有效控制比生长速率。在细胞生长期, 提供充分的营养, 供细胞的需要; 在产物合成期, 降低葡萄糖和谷氨酰胺的浓度或流量, 降低比生长速率, 增加目标蛋白的产率。3. 4 　代谢产物的去除通常使用透析膜, 超滤腊或吸附剂选择性去除乳酸、氨或铵离子。有人建议加化学试剂比如钾盐来消除氨的影响, 也有人建议可使用有谷氨酰胺合成酶的细胞。　　灌注培养发展到现在, 还有