发酵工程(fermentation) 第一节概述一、发酵（fermentation) 的定义：用生物催化剂（Biocatalyst) 使培养物质转变成产品的生物化学反应。** 生物催化剂：细菌、放线菌、真菌或其解体产物（如酶）和动植物细胞等。发酵工程（微生物工程，发酵技术）: 指利用微生物的特定性状，通过现代工程技术，在生物的反应器中生产有用物质。二、发酵工程的历史发展19 世纪末：厌氧发酵（酒精、乳酸、发酵食品）1945 年：通气搅拌发酵罐-- 好氧发酵（青霉素等抗生素）20 世纪50 年代：代谢控制发酵（氨基酸、核酸等）20 世纪70 年代：固定化酶连续发酵20 世纪80 年代：现代发酵工程技术（与基因操作技术相结合）现在：与电子技术、基因技术等的紧密结合结合三、发酵工程在现代生物技术中的地位和作用发酵工程是生物技术产业化的基础和关键技术，是生物技术四大支柱的核心，无论传统发酵产品，如抗生素、氨基酸等，还是现代基因工程产品，如疫苗、人体蛋白质等，都需要发酵技术进行生产。四、发酵工程的主要内容1、生产菌种的选育。2 、发酵条件的优化和控制。3 、反应器的设计4 、产物的分离、提取、精制。五、发酵的类型1、微生物细胞为产物的发酵2 、微生物酶的发酵：青霉素酰化酶、淀粉酶等。3 、微生物代谢产物发酵：初级、次级代谢产物。4 、生物转化或修饰化合物的发酵工业5 、微生物废水处理和其他第二节、发酵工程中的微生物一、微生物的类群概念：通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物统称为微生物What are Microorganisms? Virus ( 病毒）Non-cell microbes Bacteria ( 细菌） Archaea ( 远古细菌）Prokaryotes( 原核生物) Algae ( 藻类）Fungi ( 真菌:酵母、霉菌）Protozoa ( 原生动物）Eukaryotes ( 真核生物（一）、细菌 结构：基本结构：细胞壁、 细胞膜和核区繁殖：主要是二分裂方式菌落：菌种鉴定的重要方式（三）、酵母酵母菌是一类单细胞真菌的俗称，分类学上分属于：子囊菌纲和半知菌类。（四）、霉菌(molds) 霉菌的菌体由分枝或不分枝的菌丝（hyphae) 构成。菌丝是真菌营养体的基本单位。 菌丝是中空管状结构，直径一般3～10μm ，有分枝，有隔膜或无隔膜1) 营养菌丝(Vegetatile hypha):  在固体培养基上伸入基内的菌丝. 行吸收养料之功能. （五）、病毒结构：核酸和衣壳（核衣壳）,有些具囊膜 增殖：吸附注入合成装配释放 三、微生物的来源（一）从自然界中选育所需微生物：2、微生物的分离： （1）样品分离前的处理：温度；膜过滤；离心；碱处理；有机溶剂处理；搅动法；土壤增殖法；诱饵法等。（2）分离方法：培养基；抗生素的加入；稀释法；滤膜法: 分离放线菌(0.22-0.45um) 培养温度和时间（3）接种分离微生物：平皿长出微生物斜面，排除相同菌株3、性能鉴定：包括菌株的毒性试验、生物活性试验和生产性能试验。（二）从菌种保藏中心索取国外：ATCC ；NRBC(IFO) ；CBS ；DSM 国内：CCCCM: 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物: 中科院微生物所;武汉病毒所医学微生物: 卫生部生物制品检定所; 中国医科院病毒所抗生素菌种保藏管理中心: 中国医科院抗生素研究所; 四川抗生素研究所;华北制药厂抗生素研究所四、菌种的选育6、培养基成分简单，来源广，价格廉。7 、对温度、pH 、离子强度等环境因素不敏感。8 、对溶氧的要求低，便于培养及降低耗能。（二）诱变育种诱变育种的过程2、菌悬液的制备：要求菌体处于对数生长期，并采取一定措施促使细胞处于同步生长；菌悬液的均一性；菌液的细胞浓度；一般用生理盐水稀释或0.1mol/L 的磷酸缓冲液处理。3、诱变：4 、菌种的筛选（1）一般变异菌的筛选方案：从菌体形态变异分析；平皿快速检测法；摇瓶培养法。（2）特殊变异菌的筛选：2.1 营养缺陷型菌株的筛选：（www.book118.com ）浓缩营养缺陷型：抗生素法；菌丝过滤法（www.book118.com ）检出所需营养缺陷型：逐个检出法；影印培养法；夹层培养法。（www.book118.com ）营养缺陷型的鉴定：2.2: 抗性突变菌株：一次性筛选（如耐高温）；阶梯性筛选；（如耐药）2.3: 抗代谢调节变异株的筛选: 摇瓶培养法初筛和复筛第一轮：一个出发菌株诱变处理选出200 个单孢子菌株初筛（瓶/株）选出50 株复筛（4瓶/株）选出5株第二轮：5 个出发菌株诱变处理5X40 株初筛（1瓶/株）选出50 株复筛（4瓶/株）选出5株四、微生物的生长营养物质氢离子浓度(pH) 温度（一）理想发酵用菌种的要求** ：1 、遗传性状稳定；2 、生长速度快，不易污染。3 、目标产物产量尽可能接近理论转化率。4 、目标产物最好分泌到胞外。5 、尽可能减少类似物的产量遗传				 变异遗传的物质基础细胞学基础分子基础三大遗传基本规律分离规律自由组合规律连锁遗传规律数量性状数量性状遗传细胞质基因细胞质遗传不可遗传变异(环境变异) 遗传变异重组(recombination) 等位基因分离与组合非等位基因自由组合连锁基因交换与重组重排(rearrangement) 染色体结构/数目变异基因突变(mutation) 核基因突变细胞质基因突变基因突变的发生基因突变的发生：在自然条件下广泛、大量存在；自然发生：自然界的因素新基因研究与利用；人工诱发：理化因素更高频率突变创造、研究与利用。基因突变形成的不同等位基因及相对性状差异是人们发现该基因(位点)存在的前提；是生物进化过程中自然选择的最根本基础；也是生物遗传育种的重要基础。突变真实性的鉴定原始材料(自然与人为因素) 发现变异体(突变体) 鉴定方法：原始材料与变异体在一致的环境条件下种植(培育)；对两类个体进行性状考察与比较分析(进行方差分析)；根据试验结果进行判定：两类个体间没有差异不可遗传变异(环境变异)；差异仍然存在存在真实差异为突变体。* 分子水平鉴定方法：蛋白质产物的差异分析；DNA 基因与性状表现的关系Beadle, G. W.(1941) 通过红色面包霉突变研究发现：基因是通过酶的作用控制性状表现，提出“一个基因一个酶”假说(如图所示)。生化突变及相关概念生化突变：由于诱变因素影响导致生物代谢功能的变异。可以对正常个体与变异个体的生化特性研究以分析基因的作用机制。野生型(wild type) 与原养型(prototroph) 野生型是指存在于自然界中没有经过基因突变，具有正常生化代谢功能的遗传类型；原养型指具有与野生型相同营养需求与表现的遗传类型，有时特指突变型恢复为与野生型相同的个体。营养缺陷型(auxotroph) 因基因突变丧失了某种生活物质合成能力，在基本培养基上不能正常生长，需加入相应营养成分的突变型红色面包霉的生化突变型野生型红色面包霉能在基本培养基上正常生长。水、无机盐、糖类、微量生物素(酶促合成) 必需的复杂有机物几种生化突变型：突变型a：精氨酸	( 精氨酸合成缺陷型)；突变型c：精氨酸或瓜氨酸( 瓜氨酸合成缺陷型)；突变型o：精氨酸、瓜氨酸或鸟氨酸					( 鸟氨酸合成缺陷型)。研究表明，精氨酸是蛋白质合成的必需氨基酸，而其合成途径为：红色面包霉生化突变的鉴定方法(1) 、突变的诱发：(2) 、突变的鉴定：1. 突变的真实性：在基本培养基上培养——	 能够生长未发生营养缺陷型突变；		 不能生长可能发生营养缺陷型突变。2. 突变的类型(哪类型营养缺陷型突变？)：	 氨基酸？(加入各种氨基酸) 不能生长。	 维生素？(加入各种维生素) 能够生长。3. 进一步鉴定具体类型：	 硫胺素(VB1) 、吡醇素(VB6) 、泛酸、肌醇。基因突变的诱发Induce of Mutation 1、物理因素诱变(1) 电离辐射诱变(2) 非电离辐射诱变2 、化学因素诱变3 、诱发突变的应用1. 电离辐射诱变1.1. 种类：粒子辐射：α射线、β射线(32P 、35S) 、中子(60 钴、137 铯)；电磁波辐射：X射线、γ射线。1.2. 方法：外照射：中子、X射线、γ射线；内照射：α射线、β射线。1.3. 原理：基因的化学物质(DNA) 发生电离作用。原发电离与次级电离。碱基对、碱基结构破坏、改变基因突变；磷酸二酯键断裂、染色体断裂重接染色体结构变异。1.4. 电离辐射诱变的作用规律辐射剂量的表示方法：X 射线、γ射线：伦琴(R) ；中子：积分流量(n/cm2) ；β射线：微居里(μcu/g) 。突变率与辐射剂量：突变率与辐射总剂量成正比；突变率与剂量率(辐射强度的影响)无关。(2) 非电离辐射诱变主要是紫外线(380-15nm) ：紫外线的作用机制：激发作用穿透能力与处理方法最有效波长260nm( 嘌呤、嘧啶的共轭环) 间接诱变作用物理诱变的非专性：对DNA 分子及其核苷酸残基无选择性，所以没有专化性和特异性可言。2. 化学因素诱变2.1. 诱变剂及其种类与作用机制：烷化剂：使碱基烷基化、改变碱基形成氢键的能力，从而改变碱基配对关系；碱基类似物：在复制过程中取代碱基渗入DNA 分子，但形成氢键的类型不同，改变碱基配对关系；抗生素：阻碍碱基合成或破坏DNA 分子结构。2.2. 作用特点：具有一定的碱基特异性。3、诱发突变的应用3.1. 提高基因突变率；3.2. 获得更丰富的突变类型；3.3. 改良生物的个别性状。1、出发菌株的选择** ： 菌株应具有特定代谢产物催化酶系的基因。来源：（a）自然界直接分离得到的野生型菌株。（b）经历生产条件考验的菌株。（c）经历多次育种处理的菌株。细菌在固体培养基中的生长情况光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落细菌在琼脂培养基中穿刺培养的生长特征细菌在半固体培养上的培养特征细菌在肉汤培养基中的表面生长特征絮状环状浮膜状膜状(二）、放线菌*（P12 ） 结构：基内菌丝、气生菌丝 繁殖：无性孢子放线菌的分布与生活方式放线菌一般分布有机物丰富和呈微生物碱性的土壤中。107 个／g左右能看到：北方春季深层黑土地的白丝能闻到：泥土特有的“泥腥味”放线菌的形态结构（模式图）基内菌丝（Substrate mycelium) 又称营养菌丝，功能是吸收营养，直径0.2-1.2um 长度100 －600um ，色素可有可无。基内菌丝基内菌丝长到一定时期，长出培养基外，伸向空间的菌丝，直径1－1.4um, 长短不一，形状不一，颜色较深。气生菌丝（Aerial mycelium) 孢子丝(Reproductive mycelium) 当气生菌丝生长发育到一定阶段，气生菌丝上分化出的可形成孢子的菌丝。孢子的形状及在气生菌丝上排列的方式随种而异。Cncnc-micro 放线菌孢子丝类型直形弯曲丛生成束单轮生无螺旋开环钩形原始螺旋形松螺旋紧螺旋螺旋单轮生无螺旋两级轮生螺旋两级轮生放线菌的菌落形态菌落质地硬而且致密，菌落小而不广泛延伸菌落