分子肿瘤学基础毒理学教研室徐德祥第一章绪论肿瘤发病的流行病学现状肿瘤发病机制的研究进展肿瘤的分子诊断研究进展一、肿瘤发病的流行病学现状1、恶性肿瘤发病和死亡率明显升高，成为人类死因的第一位（城市）或第二位（全国）；2 、恶性肿瘤的发病顺位发生了明显的变化。生活方式改变环境改变二、肿瘤发病机制的研究进展1、肿瘤的多因素多阶段多基因参与的过程2 、肿瘤的发病与体细胞突变有关3 、信号传导与肿瘤4 、细胞周期与肿瘤5 、细胞分化与肿瘤6 、细胞凋亡与肿瘤7 、肿瘤的遗传易感性肿瘤的多因素多阶段多基因参与的过程多因素多阶段：二阶段学说多阶段学说多基因参与：癌基因、抑癌基因细胞凋亡相关基因、肿瘤易感基因肿瘤的发病与体细胞突变有关癌基因：维持细胞正常生理功能所必须的基因细胞增殖、分化、信号转到体细胞突变学说：肿瘤的发生与癌基因突变有关点突变、DNA 扩增染色体重排、甲基化抑癌基因：纯合缺失或失活而引起恶性转化的基因二次突变学说（Rb 基因，视网膜母细胞瘤）遗传性视网膜母细胞瘤患者（Rb 等位基因突变或缺失）：一次突变引起发病非遗传性视网膜母细胞瘤：二次突变突变引起发病肿瘤易感性和易感基因肿瘤易感性：环境与遗传肿瘤易感基因：癌基因和抑癌基因的突变DNA 修复缺陷代谢酶基因：化学致癌三、肿瘤的分子诊断及其研究进展1、分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用肿瘤的分子诊断涉及到各种恶性肿瘤及癌前病变，主要集中在各种癌基因、抑癌基因及相关基因的检测，分别在蛋白质、RNA 、DNA 水平进行判断，为肿瘤的基础研究、肿瘤防治和个体化或预见性治疗提供更详尽的证据。（1）肿瘤易感基因的检测（2）肿瘤的分类对Bcr 区基因重排检测：可诊断慢粒并与急粒鉴别。神经母细胞瘤——N-Myc 明显扩增和过表达；神经上皮瘤——c-Myc 扩增和过表达。2 、肿瘤基因过表达及其检测（1）基因过表达的形式癌基因激活和抑癌基因失活，是肿瘤发生过程中的关键因素。癌基因产物过表达是癌基因激活的重要表现形式之一。癌基因一般为单拷贝基因，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA 复制过程中扩增，常导致基因产物过表达，表现为mRNA 和蛋白质量增加。有些抑癌基因突变后可起到癌基因的作用（如p53 基因），产生突变型蛋白。（2）基因过表达的检测①表达产物的检测：几乎所有被克隆的癌基因、抑癌基因都有相应抗体，其中大多数已商品化。免疫组化（immunohistochemistry ）酶联免疫吸附实验（ELISA ）免疫沉淀法：检测并定量分析蛋白质混合物中的靶抗原敏感（可检出100pg 的放射性标记蛋白）。与SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳并用，可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达。蛋白印迹法（Western blot ）：70 年代末80 年代初，在蛋白质凝胶电泳（分辨率高）和固相免疫测定（特异敏感）的基础上发展的，结合了二者优点，无需同位素标记，具有从混杂抗原中检出特定抗原，或从多克隆抗体中检出单克隆抗体的优势，还可对转移到固相膜上的蛋白进行连续分析，有蛋白质反应均一性、固相膜保存时间长等优点。敏感性为1～5ng 。细胞裂解—→SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳→蛋白质电转移→封闭→加一抗→加二抗→显色照像。流式细胞仪（flow cytometry ）测试法：用荧光标记抗体与含有特异抗原的细胞结合，用流式细胞仪对含不同荧光信号的细胞分类测试，可检测细胞表面受体、标志物或特异性蛋白及细胞的分类分析。②基因扩增的检测：肿瘤基因扩增可产生过量的表达蛋白，也可表现为基因拷贝数增加和转录产物mRNA 增加。经典检测方法为核酸分子杂交，包括原位杂交（in situ hydridization ，ISH ）、荧光原位杂交（FISH ）、DNA 杂交（Southern blot ）、RNA 杂交（Northern blot ）、原位PCR 、逆转录PCR （reverse transcription PCR ，RT-PCR ）。FISH 将荧光素标记克隆的DNA 片段与染色体或细胞间期染色质杂交，以测定特定的DNA 片段是否有缺失或扩增。原位PCR ：结合了PCR 与ISH 技术优点，在组织切片或细胞涂片上原位对特定DNA 或RNA 进行扩增，再用特异性探针作原位杂交检测，以达到对靶核苷酸进行定性、定位、定量分析。逆转录PCR （RT-PCR ）用来扩增从RNA 分子中得到的一段特异序列。RNA 首先被逆转录为cDNA 。用位于一段特异序列或一个基因两侧的引物生成以cDNA 为模板的PCR 产物，得到阳性产物说明存在特异性的RNA 序列。为扩增从mRNA 逆转录的cDNA ，引物中应含一段目的基因的内含子区，以使从带有基因组DNA 的PCR 产物中区分出cDNA 的PCR 产物。经典方法包括RT 和PCR 两步。（3）肿瘤基因差异表达的检测控制生物性状的基本结构和功能单位是基因，不同细胞或同一细胞的不同时间与空间基因表达的差异决定着生命活动的多样性，如发育、分化、繁殖、细胞周期调控、衰老、死亡等。实际上，细胞的各种生理过程或病理改变本质上都是由基因表达的改变所决定的。因此获取差异表达的基因将有助于了解正常生理变化和病理改变的分子机制，为基因诊断、基因治疗和发现新的药物靶分子提供新的视野。 ①DD-PCR （differential display PCR ）又称差异显示反转录PCR （DDRT-PCR ）简要流程对照组处理组↓……反转录……↓mRNA 或总RNA mRNA 或总RNA ↓……PCR………. ↓cDNA cDNA ↓↓扩增产物扩增产物↘电泳分离↙↓比较回收差异显示带↓PCR 克隆、杂交、测序↓与Genbank 数据库中的已知序列进行同源性匹配确定相关基因②RSDD （交互式差减差异RNA 显示，reciprocal subtraction differential RNA display ）：DD-PCR 中采用差减过的RNA 或cDNA 样品。1998 年Kang 等，分析了腺病毒转化的大鼠胚胎细胞株E11 和获得侵袭性致癌表型的E11-NMT 细胞株间的差异表达基因。E11 cDNA 文库E11-NMT cDNA 文库↓↓交互式差减E11 减E11-NMT 差减cDNA 文库E11-NMT 减E11 差减cDNA 文库↓体内切割↓以锚定引物和5’随机引物PCR 扩增↓显示5% 测序胶显示并分离差异条带↓再扩增，反向Northern 分析↓Northern blot 分析表达分析↓克隆并测序，Northern blot 确证（4）基因突变的检测①PCR-SSCP 法（PCR-single strand conformational polymorphism ，聚合酶链反应－单链构象多态分析）：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，即使有一个碱基不同，也会形成不同的二级结构而出现不同的迁移率。靶DNA 或RNA 经PCR 扩增后，产物变性处理，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ），靶DNA 或RNA 中含有单个碱基置换、数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化就出现泳动变位，从而检测出含有基因突变的DNA 或RNA 片段。②杂合双链分析法（Heteroduplex analysis ，HA ）：由突变型和野生型DNA 形成的异源杂合双链在其错配处会形成突起，在非变性胶中电泳时，会产生与相应的同源双链DNA 不同的迁移率。③突变体富集PCR 法（mutant-enriched PCR ）：利用癌基因或抑癌基因某个编码子部位存在的已知限制性内切酶位点，用连续2次巢式PCR 对包括酶切位点的DNA 片段进行扩增，在2次PCR 之间用相应的内切酶消化扩增产物，野生型因酶切不能进入第2次PCR ，而突变型则能完整进入第2次PCR 并得到产物的富集。④变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis ，DGGE ）：双链DNA 在沿变性剂（甲醛或尿素）电场方向递增的凝胶中进行到与DNA 变性温度（Tm ）一致的位置时，DNA 发生部分解链，迁移率下降。正常DNA 分子与突变DNA 分子间即使只有一个碱基对的差异，也会在不同位置解链，导致迁移率不同而被分离。两个同源双链DNA 分子间有一个碱基对不同时，Tm 值就相差1℃或更高，有一个碱基错配的异源双链DNA 分子与同源双链DNA 分子比较，其Tm 值可相差6℃以上。⑤DNA 芯片技术（DNA chip ）：建立在杂交测序基本理论上的DNA 分析技术。利用固定在芯片上的几万至几十万条探针与样品杂交，在一步实验中获取大量信息。可用于基因定位、DNA 测序、突变分析、表达分析、基因多态性分析、物理图谱和遗传图谱的构建等。使用了光控固相化学合成、集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针等多项先进技术，实验全部自动化，操作极简便，可节约大量时间和实验成本。将许多已知序列的寡核苷酸DNA 排列在一块集成电路板上，彼此间重叠1个碱基，并覆盖全部检测基因。将荧光标记的正常和突变DNA 分别与两块DNA 芯片杂交，因至少存在1个碱基差异，将得到不同的杂交图谱，用共聚焦显微镜分别检测其荧光信号，即可确定是否存在突变。蛋白质芯片、组织和细胞芯片⑥连接酶链反应（ligase chain reaction ，LCR ）：双链DNA 经加热变性后，用2对互补寡核苷酸引物与模板复性。若引物序列与目标序列完全配对，那么2对引物将与各自的目标片段杂交，并在连接酶作用下发生连接。连接产物作为下一次循环的模板。若点突变出现在目标片段上，将不能进行连接反应，不会出现连接产物。⑦等位基因特异性扩增法（allele-specific amplification ，ASA ）：设计2个等位基因特异的5’端引物（一个对野生型特异，一个对突变型特异特异）。对于纯合型突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行PCR ，只有与突变DNA 完全互补的引物才能延伸得到PCR 产物；对于杂合性突变需定量分析。若错配位于引物3’端，则PCR 不能延伸，称为ARMS （amplification refractory mutation system ）；若错配位于引物之间而影响引物退火，称COP 或CCA （competiive oligonucleotide priming ，color complementation assay ）。⑧染色体分析：肿瘤细胞的染色体畸变是一非常普遍的现象，可分为原发和继发2类：原发性染色体畸变与引起肿瘤的直接原因有关。肿瘤细胞中可发现各种形式的染色体畸变，如缺失、重复、易位、重排、断裂、核内再复制等。继发性染色体畸变主要是肿瘤细胞核型的改变。FISH ：利用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，可同时检测间期与中期细胞的若干个特异性核酸序列。从而能检测多个基因，分辨复杂的染色体易位和微小缺失，区分间期细胞多倍体与超二倍体等。主要原理：基本反应包括在溶液中经化学修饰的单链探针DNA 序列与固定于载玻片上经变性的单链互补DNA 序列间形成异质双链，再用与荧光素（FITC ）结合的阅读分子定位化学修饰的探针。在总的DNA 背景上出现有清晰界限的荧光斑点或成簇的荧光斑点。PRINS 技术（寡核苷