（三）分子杂交：( hybridization)不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的杂化双链( heterodup lex)，这个过程称为杂交( hybridization)。杂交可以发生于DNA 与DNA 之间，也可以发生于RNA 与RNA 之间和DNA 与RNA 之间。例如，一段天然的DNA 和这段DNA 的缺失突变体(假定这种突变是DNA 分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓起小泡。测定小泡位置和长度，可确定缺失突变发生的部位和缺失的多少。核酸的分离纯化测定及研究方法一、分离核酸的一般原则因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：（二）核酸的纯度要求①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA 分子时，应去除RNA，反之亦然。核酸的分离纯化测定及研究方法（三）核酸分离纯化的注意事项为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10 条件下进行；③防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA 酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+ 的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA 或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA 酶的活性。而RNA 酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA 提取过程中的主要危害因素；核酸的分离纯化测定及研究方法④减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA 样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA 分子，如真核细胞的染色体DNA 等。高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为0～4℃以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。核酸的分离纯化测定及研究方法二、核酸分离纯化的一般步骤破碎细胞→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子→沉淀核酸→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯化干燥→溶解核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。核酸的分离纯化测定及研究方法三、核酸的测定方法1、紫外吸收法在一定pH 下测定样品的紫外吸光度（A260），即可由下式计算样品中的核酸含量：C=Mr×A260/ε×L 其中：C 为核酸的含量（mg/mL），Mr 为相对分子质量，A260 为核酸溶液的吸光度，ε为摩尔消光系数（即1升溶液中含1摩尔核酸的光吸收值），L 为比色杯的内径（cm）核酸的分离纯化测定及研究方法2、定糖法RNA 的测定：RNA 分子中所含的核糖经浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛，糠醛可与3，5-二羟甲苯（苔黑酚或地衣酚）反应生成绿色化合物，该化合物可在670-680 nm 波长下进行比色测定。DNA 的测定：DNA 分子中的脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺反应生成兰色化合物，该化合物可在595-620 nm 波长下进行比色测定。* 核酸的理化性质核酸的分离纯化、测定及研究方法核酸的理化性质核酸的性质是由其结构决定的。核酸的结构特点是分子大,有一些可解离的基团,具有共轭双键等.这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性质的基础.下面介绍几种重要的性质: 一、物理性质1、性状：RNA 及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色的粉末或结晶；DNA 则为疏松的石棉一样的纤维状固体。2、溶解性：RNA 和DNA 都是极性的化合物，一般说来，这些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。DNA 和RNA 在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DNA 核蛋白与RNA 核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。DNA 蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1 mol/L 的NaC 溶液中溶解度比纯水高2倍，在0.14 mol/L 的NaCl 溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解；而RNA 蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14 mol/L 的NaCl 溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。3、粘性：核酸的水溶液粘度很大，粘度DNA 大于RNA。核酸变性后，粘度下降。二、核酸的水解粘性末端末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA 片段连结，故称为粘性末端。这种酶在基因工程中应用最多。平头末端在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无粘性末端的平口三、核酸的两性电离与等电点核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA 的pI 约为4～5，RNA 的pI 约为2.0～2.5，在pH7～8 电泳时泳向正极。四、UV 吸收：核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质，在260 nm 处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。五、DNA 的变性、复性与分子杂交DNA 双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释DNA 的重要特性变性与复性，这对于深入了解DNA 分子结构与功能的关系又有重要意义。（一）DNA 变性( denaturation) 1、DNA 变性的概念：指DNA 分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。2、DNA 变性的本质：维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。3、导致DNA 变性的因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性4、变性DNA 的特征：（1）溶液粘度降低：DNA 双螺旋是紧密的刚性结构，变性后转化成柔软而松散的无规则单股线性结构，因此粘度明显下降。（2）旋光性发生变化：变性后整个DNA 分子的对称性及分子构型改变，使DNA 溶液的旋光性发生变化。（3）紫外吸收增强。增色效应( hyperchromic effect)：指DNA 变性后其紫外吸收明显增强的效应。DNA 分子中碱基间电子的相互作用使DNA 分子具有吸收260 nm 波长紫外光的特性。在DNA 双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA 双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。对双链DNA 进行加热变性，当温度升高到一定高度时，DNA 溶液在260 nm 处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。若以温度对DNA 溶液的紫外吸光率作图，得到的典型DNA 变性曲线呈S 型如上图所示。可见，DNA 变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称融解温度( Tm,melting temperature)。在Tm 时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的Tm 值与其G＋C 所占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表示为：Tm = 69.3＋0.41(G+C)%一定条件下(相对较短的核酸分子)，Tm 值大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm 值越大；另外，溶液的离子强度较低时，Tm 值较低，融点范围也较宽，反之亦然，因此DNA 制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。(二) DNA 的热变性与复性( renaturation) 指经加热变性的DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性DNA 一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火( annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。DNA 的复性不仅受温度影响，还受DNA 自身特性等其它因素的影响：1、温度和时间：一般认为比Tm 低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm 的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA 的变性(单链)状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。2、DNA 浓度：溶液中DNA 分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利于复性。3、DNA 顺序的复杂性：简单顺序的DNA 分子，如多聚( A) 和多聚( U) 这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补，则困难得多。DNA 的变性和复性原理，现已在医学和生命科学上得到广泛的应用。如核酸杂交与探针技术，聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR) 技术等。*
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