临床检验中的发光免疫分析原理、优势和值得注意的问题北京大学医学部研究员中国生物物理学会光生物学专业委员会副主任委员国际生物发光和化学发光学会( ISBC ）学术理事Council member of scientific advisory board of International Society on Bioluminescence & Chemiluminescence 发光（Luminescence ）化学发光（Chemiluminescence ）生物发光（Bioluminescence ）化学发光的分类酶促化学发光：辣根过氧化物酶系统碱性磷酸酶系统黄嘌呤氧化酶系统非酶促化学发光：吖啶酯系统草酸酯系统三价铁-鲁米诺系统闪光与辉光及其测量方式的差别免疫分析结果的干扰因素化验结果与临床不符的原因目前商品化发光免疫分析产品的几个特点大多采用全自动工作方式，部分采用微孔板半自动方式多采用磁性或非磁性微粒包被，以增加表面积，使反应时间缩短使用内建标准曲线加校正的办法产生工作曲线部分产品采用流动池测定方式(适合于闪光型发光或电化学发光) 流动池检测方式示意图检测器检测池负压泵废液四通阀冲洗液样品管计量泵干燥空气原位进样泵氧化剂优点：结构简单，运行成本低缺点：易产生交叉污染，工作效率受限标准化——自动化免疫分析系统对试剂盒的技术要求对仪器的要求：结构简单、运行效率高、故障率低、维护费用少对试剂盒的相应要求：标准化、成套化、简单化，具体为：反应/洗涤/测定条件一致；操作步骤少且趋于一致反应时间短；通用成分多、专用成分少措施统一标记/检测系统重新优化并统一反应/洗涤/测定条件和操作步骤改变包被模式：微粒包被：反应效率↑，反应时间↓；散射干扰↑、离子干扰↑（磁珠）间接包被：反应效率↓，反应时间↑；散射干扰↓、检测效率↑注意内源性物质干扰！（生物素-亲合素系统）微粒+间接包被：间接包被夹心法原理包被体待测抗原间接包被物标记抗体俘获抗体特点：所有试剂盒均采用同一包被物和结合配体结合配体工作曲线的特点与校正原理工作曲线四要素拟合方式：描述曲线基本形状，取决于实验模式和剂量-效应关系走向。截距：描述曲线位置，修正依据为本底信号和系统误差，修正后导致曲线平移。斜率：描述曲线俯仰角度，修正依据为结合/反应/检测效率。修正后导致曲线旋转。变形因子：调整曲线形状（取决于抗体活性和特异干扰因素变化）信号强度（Y）待测物浓度（X）基本形状平移旋转变形常见拟合方式的性质及其参数的含义B/A C/A D A 曲线Y=A*[X3+(B/A)*X2+(C/A)*X]+D Y=A*X3+B*X2+C*X+D 三次曲线A B C D-C 曲线Y=(D-C)/[1+(X/A)B]+C Y=(D-C)/[1+(X/A)B]+C 四参数A B N Y0-N 曲线Y =(Y0-N) * eB*XA/(1+ eB*XA) + N ln[P/(1-P)]= A*lnX+B P=(Y-N)/(Y0-N) log-Logit A N (Y0-N) * 10B A=1 直线A≠1 曲线Y= (Y0-N) * 10B*XA+ N Log[ （Y-N ）/(Y0-N)] =A*logX+B 对数/ 变形B 截距A 斜率直线性质Y=A*X+B 剂量-反应关系Y=A*X+B 拟合方程线性拟合方式X：待测物浓度；Y ：信号强度；Y0 ：零浓度样品信号强度; N ：非特异结合信号强度（NSB ）漂亮的拟合曲线决不是实验结果准确的唯一保证！！！定值/非定值质控血清才是监控数据可靠性的主要手段！（谨防作弊软件）使用商品化发光免疫分析产品可能遇到的几个问题与以往方法（放免等）在检测指标的正常值及临床意义上的差异。如：免疫源性胰岛素与真胰岛素、HCG 、性激素等采用不同的单抗或多抗时检测结果也有较大差异。（单抗特异性好，受干扰小，因此测值低）不同厂家产品测定结果之间一致性差（未与国家标准品比对）。所使用的内建标准曲线结合校正的方法不尽完善。部分产品不显示原始数据，无法监控其准确性。温度氧化剂还原剂光线磁场金属离子防腐剂杂质本底物质结合蛋白（测定小分子）同一干扰因素对不同检测方法的不同影响待测物包被（结合）抗体放免法免放或发光法标记抗原TBG 离心沉降洗涤祛除以甲状腺素结合蛋白（TBG ）干扰竞争法测定T3 为例信号↑结果↓信号↓结果↑使用商品化发光免疫分析产品必须做好的几个工作在厂家提供的数据基础上，自行建立正常参考值系统。明确各个试剂盒的特异性及交叉反应情况如：小分子激素之间，以及与自身前体或代谢物之间的交叉胰岛素与C- 肽、胰岛素原之间的交叉FSH 、LH 、HCG 之间的交叉。充分利用现有国标参考品校正结果（注意防腐剂干扰）（可以从国家药品生物制品检定所或临床检验中心得到）自行建立多点质控（2-3 点）监控每次实验的准确性。尽可能避免干扰因素采样：清洁样品管（防止还原剂干扰）、不使用酶抑制剂、及时送检实验室：恒温、避免强光和强磁场、严格操作规程、及时维护、报修正常值参考的意义及灰色区域的存在如果测定结果处于灰色区域（约在正常值上下限以内20% ）内，则需要进一步追踪检查。95% 或99% -20% +20% 自身基础数据——最佳“正常参考值”对于患者来讲，最佳的参考值是自己以往的测定数据，即自身对照；因此积累病人的基础数据非常重要。尤其是性激素、生长激素、胰岛素等具有周期性分泌或释放规律的激素。时间FSH 卵泡期排卵期黄体期月经期正常人平均值变化规律正常参考值范围某一患者变化规律（无排卵峰）灵敏度（真阳性率）：对真阳性病例的检出率，即=检出阳性病例数/总受检阳性病例数特异度（真阴性率）：对真阴性病例报阴性的比率，即=报阴性结果数/总受检正常人数若某肿瘤筛查法的指标达到理论极限，即灵敏度100% ，特异度99% （正常值为99% 可信限）而肿瘤的发病率多在十万分之三十以下，因此其应用于正常人群体检时，总阳性病例可能为：30+ （100,000-30 ）×（1-99% ）=30+999.7≈1030 ；其中，假阳性率=999.7/1030 × 100%=97% 绝大部分为假阳性！！！因此，筛查指标的意义在于高危人群的早期预警，而决不是疾病确诊！改进办法：采用多个厂家的产品或多指标联合测定（艾滋、肿瘤）串联实验：多个检测均阳性才定为阳性，假阳性（误诊）↓，假阴性（漏诊）↑并联实验：一个指标阳性就定为阳性，假阳性（误诊）↑，假阴性（漏诊）↓取舍原则：分别对误诊和漏诊带来的医学、经济、社会、伦理风险综合分析平衡低发病率疾病的筛查指标用于普通人群产生的巨大“困惑”由于个体差异或不明干扰因素的存在，总有少数病例的化验结果与其临床表现不符操作失误、仪器故障、试剂失活等因素一步夹心法测值低可能存在前滞效应药物以及其它基础疾病的干扰排除这些因素后重复测定或重复送样用同试剂盒的校准品A 稀释后再重新测定及时与临床沟通结合说明书综合判断原因解决所有夹心法均强信号往往存在异嗜性抗体用小鼠血清稀释样品找厂家索取拮抗剂不同实验方法，或同一方法的不同厂家产品之间，其测定结果和临床正常值都会有所差异不同实验室环境和不同人群条件下，其测定结果和临床正常值也会有所不同在厂家提供的正常参考值基础上建立自己的正常参考系统待测物的降解及其与血清蛋白结合状态的改变检测结果受标本存放时间及条件的影响及时采样、送检，实验室及时完成化验，严格按照试剂盒说明书要求存放感谢各位捧场！欢迎批评指正！* * 杨晓林由于化学反应（通常是氧化）或生物化学反应产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量并产生光子，从而导致的发光现象。与荧光最大的区别在于无需激发光，因此后者也被称为光致发光。生物发光和化学发光均属于冷光，即发光不是由于发光体温度升高所致，因此其反应能量绝大部分用于发光而不是发热，发射波长也与温度无关。发光测定属发射光谱分析，多采用动力/速率法或积分法，无需终止反应，也不受朗伯-比尔定律限制；而酶标显色测定属吸收光谱分析，多采用终点法，需终止反应，并受朗伯-比尔定律限制。按化学反应类型闪光（Flash ）: 按发光持续时间发光时间在数十分钟以上，如：HRP-Luminol 系统AP-AMPPD 系统黄嘌呤氧化酶系统无须原位进样、以速率法测量。发光时间在数秒内，如吖啶酯以原位进样(In Situ Injector) 和时间积分法测量辉光（Glow ）: 时间发光信号辉光坪区速率法测量原位进样积分法测量闪光尖峰鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统H2O2+ NH2 O O NH NH N2 OH- HRP NH2 CO2- CO2- +Photon (425nm) R OH R OH N S R B OH OH 增强剂（Enhancer ）商业化产品中常见的化学发光系统（一）AMPPD 及其衍生物的化学发光系统+ * 光子(477nm) AP O O OCH3 OPO32- O- O O OCH3 O O- O OCH3 商业化产品中常见的化学发光系统（二）CH3 C=O O R N+ OH- H+ H2O2 + H2O + R OH 光子+ CO2 + CH3 C=O O R N HO CH3 C=O O R N HOO CH3 O N CH3 O N C=O O 商业化产品中常见的化学发光系统（三）吖啶酯化学发光系统发光检测的剂量-- 反应关系曲线信号强度（Y）实际曲线标记物浓度（X）理论/校正曲线由于：不同发光体系和免疫分析模式具有不同的实际信号曲线因此：科学准确的特定校正技术是衡量设备和试剂匹配性的关键发光信号检测光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD ）结构简单、性能稳定但灵敏度低、线性范围较窄。主要特点原理：光信号光电转换器件电压或电流信号放大单光子计数器是目前高灵敏度发光分析仪的核心部件光电倍增管高压高速放大器高速比较器高速分频器发光样品产生光子激发光阴极产生光电子在阳极上形成较强信号脉冲信号相对发光单位数字脉冲(RLU) 在各打拿极之间得到能量和数目的倍增单光子计数器的工作特性光子计数（Y）发光强度（X）饱和点理论/校正曲线实际计数曲线由于：单光子计数是在检测随机光子事件因此：随光子数量增多检测效率持续下降所以：准确的校正技术是设备品质的关键模拟（光电流）测量曲线单光子计数式发光检测仪计算机打印机发光仪控制模块发光仪执行模块控制器程控高压计数/贮存器单光子计数器样品运动/定位装置程控自动门锁及检测装置原位注射泵光生物学技术的应用范围军事侦测公安稽查卫生检疫药物筛查医学诊断环境检测航天遥感生命科学……已成为现代生物技术最活跃的领域之一光生物学检测技术的优越性彻底消除了放射性危害无半衰期限制，试剂稳定性和有效期大大延长容易实现连续、动态、重复测定适合于复合标记系统进行多指标并行测定操作简单，反应速度快，容易实现自动化灵敏度和线性范围超过以往技术几种标记/检测技术理论极限灵敏度的比较酶标荧光放免发光灵敏度(mol/L) 10-18 10-15 10-12 10-9 几种标记/检测技术理论线性范围的比较酶标荧光放免发光线性范围105 1