上海交通大学附属瑞金医院上海血液学研究所王鸿利王学锋等研究方法-临床诊断出血病以血友病A 为例出血为特征大关节肌肉腰大肌内脏皮肤粘膜皮肤淤斑颅内出血研究方法-家系调查（FVIII) 研究方法-家系调查（FVII) 研究方法-筛选试验和表型诊断实验研究方法-筛选试验和表型诊断实验研究方法-筛选试验和表型诊断实验研究方法-筛选试验和表型诊断实验研究方法-分子（基因）诊断研究方法-分子（基因）诊断研究方法-分子（基因）诊断研究方法-分子（基因）诊断研究方法-分子（基因）诊断研究方法-体外表达研究研究方法-血友病携带者和产前诊断血友病A 基因治疗的目的和意义血友病A 的基因治疗靶细胞的选择生理情况下FVIII 在肝细胞和肝窦状核细胞中表达，可以作为基因治疗靶细胞的有：内皮细胞N1H3T3 细胞纤维母细胞CHO 细胞骨髓基质细胞COS-7 细胞造血干细胞L-02 细胞巨核细胞，等。体外受精胚胎发育6-8 细胞1~2 个单卵裂球细胞FVIII/IX 基因分析正常胚胎植入宫内活检取单个细胞单细胞PCR 技术植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis ，PGD ）研究方法凝血因子性质抗凝因子性质凝血/抗凝因子机制12 35 凝血因子XI 缺陷症161 49 16 39 896 822 127 24 32 33 国外4 14 4 1 4 国内基因突变种类15，16 14 13 11 9，10 7，8 5，6 3，4 2 1 参考文献遗传性凝血因子缺陷症种类血管性血友病凝血因子XIII 缺陷症凝血因子XII 缺陷症凝血因子X 缺陷症凝血因子IX 缺陷症凝血因子VIII 缺陷症凝血因子VII 缺陷症凝血因子V 缺陷症凝血酶原缺陷症无（异常）纤维蛋白原血症国内外研究现状国内外研究现状148 335 127 国外1 2 国内基因突变种类20 18，19 17 参考文献抗凝因子缺陷症种类蛋白S 缺陷症蛋白C 缺陷症抗凝血酶缺陷症国内外研究现状( PGD) 国际报道45种相关基因突变R1374S，S1506L  2 血管性血友病1627 位的C/T  1 凝血因子ⅪI 缺陷症突变位点数量遗传性凝血因子缺陷症蛋白C 缺陷症抗凝血酶缺陷症凝血因子Ⅺ缺陷症凝血因子Ⅹ缺陷症凝血因子Ⅸ缺陷症凝血因子VIII 缺陷凝血因子Ⅶ缺陷症低（无）纤维蛋白原血症Arg15Trp, Phe139Val, K 150 或151 del  Val404Thr 3 1 Glu323Lys  1 Thr318Met  1 启动子区A13G, G6463A, G17747C G20414A, G308648A  5 Arg531Cys, Arg538 Stop, Ala704Thr, Tyr1680Cys, Arg1966Stop, Arg2116Stop, Arg2150His, Arg2209Stop  8 Arg304Trp、Arg304Gln、Trp359Met、Arg353Gln, His348Gln、Arg152Gln、IVS1+5G >A、启动子-55 G→T、-323insertion(-323po/p10)、G73A 11 FgFGA 基因4 bp del (g1892~1899) 和1238 bp del（g1978~3215）, FGB Arg17Stop, Gly347Arg,FGG Arg275His 5 国内首次报道38种相关基因突变43 分泌障碍，降解加速Ser413Trp ，Arg77Cys 凝血因子XIII 缺陷症滞留，降解加速（13889delG）；功能障碍（C2603T）；滞留（C2759T）分泌障碍，降解加速形成二聚体的滞留分泌障碍分泌正常，功能障碍滞留、降解（Phe40Cys），无凝血活性（IVS1a+g>a）分子发病机制Ser-30Arg 凝血因子X 缺陷症13889delG. C2603T、C2759T Cys64Trp, Phe139Val Leu172Pro Gly400Val His99Arg Phe40Cys, IVS1a+g>a 基因突变位点蛋白C 缺陷症44 抗凝血酶缺陷症凝血因子XI 缺陷症凝血因子VIII 缺陷症42 凝血因子VII 缺陷症参考文献类别突变基因的体外表达研究时瑞杰血友病A 的基因治疗* * 遗传性凝血因子和抗凝因子缺陷症的诊断与血友病A 的基因治疗研究背景遗传性凝血因子缺陷症和抗凝因子缺陷症分别导致遗传性出血病和血栓病患者往往自幼发病，持续终生，致残率高、危害性大、甚至导致死亡，并遗传至后代替代治疗仍是目前唯一有效的治疗手段，基因治疗是根治本病的最佳选择研究内容研究对象q p 40 74 血友病A 6 17 血友病B 46 产前诊断91 携带者诊断合计项目研究对象家系资料实验表型基因诊断临床资料体外表达研究临床诊断临床治疗研究流程研究方法-临床诊断血栓病以抗凝血酶缺陷症为例浅静脉炎深静脉血栓内脏静脉血栓肺栓塞研究方法-家系调查（AT 缺陷症) 1. 凝血因子缺陷症筛选试验：①APTT↑，PT 正常：因子VIII 缺陷症（血友病A ）、因子IX 缺陷症（血友病B ）、因子XI 缺陷症因子XII 缺陷症②APTT 正常，PT↑：因子VII 缺陷症③APTT↑，PT↑：因子X 缺陷症、因子V 缺陷症、凝血酶原缺陷症、纤维蛋白原（Fg ）缺陷症④APTT 正常，PT 正常：因子XIII 缺陷症2.vWD 筛选试验：①BT ②APTT  ③FVIII:C  3. 抗凝因子缺陷筛选试验：①APCR ②proGlobal 试验4. 凝血因子缺陷症表型诊断试验：Fg(clauss 法) FII:Ag  FII:C FV:Ag  FV:C  FVII:Ag FVII:C FVIII:Ag  FVIII:C FIX:Ag FIX:C FX:Ag FX:C FXI:Ag  FXI:C FXII:Ag  FXII:C FXIII:Ag  FXIII:C vWFR:cof  vWF:Ag 多聚体分析AT:A  AT:Ag PC:A PC:Ag TPS:A  FPS:A t-PA:A t-PA:Ag  PAI:A  PAI:Ag  PLG:A PLG:Ag α2-AP:A  α2-AP:Ag TAFI:A  TAFI:Ag 5. 抗凝因子缺陷症的表型诊断试验：研究方法-分子（基因）诊断DNA/RNA 抽提RFLP PCR 扩增（RT-PCR、ASPCR）直接核酸测序DGGE 检测流程研究方法-分子（基因）诊断3.因子VIII 缺陷症（血友病A ）：基因位点检测：BclI 、CA13 、CA22 的STR 以及DXS52 （ST14 ）阳性率49% 直接测序阳性率100 ％4.因子IX 缺陷症（血友病B ）：用长距离PCR （LD-PCR ）测定DXS102 、DXS1211 、DXS1192 、DXS8031 、DXS8094 和DXS1227 等6 个位点的STR 作基因分析，阳性率达100% 5.其他凝血因子缺陷症：无（异常）纤维蛋白原血症、凝血酶原缺陷症、因子V 、VII 、X 、XI 、XII、XIII 缺陷症采用PCR 扩增所有外显子及其侧翼序列，基因测序的方法进行基因诊断采用限制性酶切分析（RFLP) 或等位基因特异性PCR（ASPCR）对发现的基因突变进行验证6.抗凝因子缺陷症：AT 缺陷症、PC 缺陷症、PS 缺陷症采用PCR 扩增所有外显子及其侧翼序列，基因测序的方法进行基因诊断采用限制性酶切分析或ASPCR 对发现的基因突变进行验证转染真核细胞生物代谢标记活性与抗原检测免疫荧光染色Western 印迹构建突变基因cDNA 的表达载体研究方法-体外表达研究研究流程Hewitt J,et al.Severe FVII deficiency caused by a new point mutation combined with a previously undetected gene deletion. Br J Haematol. 2005;128(3):380-5. 其他研究: 根据突变位点的特殊性，设计特异性的功能研究试验例如针对在信号肽或糖基化位点发生的突变等，可采用体外无细胞蛋白翻译试验，研究突变导致缺陷症的详细分子发病机制PCR 扩增外周血DNA 抽提（携带者）羊水DNA 抽提（胎儿）直接核酸测析间接联锁分析明确诊断内含子1,22倒位研究方法-血友病携带者和产前诊断Lavery S.Preimplantation genetic diagnosis: new reproductive options for carriers of haemophilia. Haemophilia. 2004;10 :126-32 研究流程传统方法：采集羊水单细胞植入前诊断研究方法-携带者和产前诊断传统方法血友病A FⅧ内含子22 倒位（INV22 ）、DXS52 、BclⅠ、内含子13 （CA13 ）和内含子22 （CA22 ）等5 个基因位点进行检测血友病B 应用DXS102 、DXS1211 、DXS1192 、DXS8031 、DXS8094 和DXS1227 等6 个位点的STR 作基因分析*  * * * * *  时瑞杰