用于出血和血栓性疾病治疗的血液制品中国医学科学院输血研究所王憬惺 用于出血或血栓性疾病治疗的血液制品  及其临床适应症 血源性血液制品 冷沉淀制品、凝血因子VIII 浓缩制品、凝血酶原复合物制品、凝血因子IX 浓缩制品纤维蛋白原制品、纤维蛋白粘合剂抗凝血酶III 、蛋白C制品 临床使用安全性的现状基因重组的血液制品▲重组人凝血因子VIII▲重组人凝血因子VIIa  重组人凝血因子IX 重组人激活的蛋白C （Activated protein C ） 制造及临床使用的概况  一、血源性血液制品临床使用安全性的现状   通过血源性血液制品传播的主要病毒－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 病毒经血细胞传播经血浆和血液制品传播 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－  HAV 十十  HBV  十十  HCV 十十 HIV- l 十十 HIV- 2 十十 B 19PV 十十 WNV 十十 SARS ？？ vCJD ?! ?! －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－血源性凝血因子VIII 传播HIV 的惨痛教训   在HIV 检测技术和血液制品病毒灭活技术未被实际使用前，血友病患者面临很高的感染艾滋病的危险: 法国、德国和加拿大的状告政府案、美国的状告拜耳公司案、日本的状告政府和绿十字公司案 我国1985 年就报道了在浙江省18 例使用过进口凝血因子VIII 制剂的血友病患者中查出４例HIV 抗体阳性者； 至2003 年11 月30 日，我国的血友病患者中，已经有62 人因使用国产未经病毒灭活处理的凝血因子VIII 制剂感染了艾滋病病毒。 2. 我国为保障血液制品临床使用安全 性已采取的措施  血液安全是一项系统工程，为保障血液制品临床使用的安全性，我国采取了下列综合措施： （1）1984 年9月17 日, 中国政府发布了“关于限制进口血液制品防止AIDS 病传入我国的通知”;    同年，血液制品病毒灭活技术的研究在中国医学科学院输血研究所启动，1992 年开始实际用于凝血因子VIII 浓缩制品和静脉注射免疫球蛋白制品的生产。（2）中国从1993 年开始将HIV 抗体检测和HCV 抗体检测同时列为献血者筛查的必检项目；并根据我国HBV 的人群高携带率的特点，对于血液制品原料血浆的供浆者，供浆前需进行乙型肝炎疫苗的免疫接种。（3）1995 年7月20 日,中国卫生部下发了“关于禁止生产和临床使用未经病毒去除或灭活的凝血因子类血液制品的通知”，使我国生产的血液制品的安全性得到进一步提高。（4）1997 年12 月29 日,“中华人民共和国献血法”颁布，中国开始告别有偿供血，进入无偿献血的新阶段。也从血液来源的层面，进一步提高了输血和血液制品的安全性。因此，我国目前生产和使用的血液制品，在病毒安全性方面是历史上最高的。和提供临床使用的全血和血细胞成分相比，由于在血液制品的生产过程中全部采用了病毒去除和/或灭活处理的措施，有更高的安全性。 但是，和提供临床使用的全血和血细胞成分一样，血液制品的临床使用至今仍不是100 ％安全的。 和发达国家相比，在保障血液制品临床使用安全性所采取的措施方面，也仍有一定的差距。3. 发达国家为保障血液制品临床 使用安全性已采取的措施 发达国家血液安全措施随技术进步而更新： （1）检测（2）血浆储存（3）新病原体二、基因重组血液制品临床使用的概况 由于血源性血液制品有传播病毒性疾病的危险，而基因重组血液制品不仅纯度极高，又无传播病毒性疾病之虞，使基因重组技术生产血液制品这一开发领域十分活跃。目前，已形成商品供应临床使用的有凝血因子VIII 、凝血因子VIIa 、凝血因子IX 和激活的蛋白C四种基因重组血液制品。 基因重组凝血因子VIII 不仅已在临床使用的份额上与血源性凝血因子VIII 产品平分秋色，更可望在5年内（至2010 年）在临床使用的份额上占主导地位；基因重组凝血因子VIIa 则已成为非常有特色的产品，在临床的使用日趋广泛。（一）重组人凝血因子VIII （rhFVIII ）1. 凝血因子VIII 的分子生物学 凝血因子VIII ( FVIII ) 基因位于X染色体长臂( Xq28 ), 基因长度为186kb, 有26 个外显子和25 个内显子。其mRNA 长度为9kb, 编码由2351 个氨基酸残基组成的FVIII 前体多肽，切除N末端由19 个氨基酸残基组成的信号肽后，成熟的FVIII 分子由2332 个氨基酸残基组成。  在血浆中，FVIII 是由一条从C端衍生来的分子量为80kd 的轻链( A3-C1-C2) 和一条从N端衍生来的分子量为90-200kd 的重链( A1-A2, 或A1-A2-B ) 组成；轻、重链之间经Ca2+ 以非共价键相结合。重链与FVIII 促凝活性( FVIII:C ) 有关，轻链则对FVIII 和von Willebrand 因子( vWF ) 的结合具有重要性。2. 基因工程FVIII 制品的生产和临床应用(1) 基因工程FVIII 制品的生产 ①FVIII 基因在基因工程改造后的哺乳动物细胞内的表达：如美国Baxter 公司选用中国仓鼠卵巢细胞( CHO ) 株，重组基因可同时表达重组FVIII ( r FVIII ) 和重组vWF ( r vWF ) 蛋白；由于vWF 是rFVIII 的稳定成分，是在细胞培养基中生产rFVIII 所必需的，因此生产细胞株本身同时表达rvWF 乃是一种既经济又易于控制的过程。②重组因子VIII ( Recombinate ) 的制备过程   A. 建立适用于生产的细胞库体系，包括：主细胞库( MCB ) 、工作细胞库( WCB ) 、延伸细胞库( ECB ) 和中间细胞库( ICB ) 。  B. 对WCB 的细胞进行一系列鉴定，以确保每一批都符合预定的标准：a. 致肿瘤性; b. 鉴别试验; c. 生产性能标准; d. 工作细胞库的稳定性。  C. 重组细胞的扩增培养, 收获细胞悬液, 经分离、免疫亲和层析、以及两种离子交换层析的纯化过程，就可获得rFVIII 制品。③rFVIII 制品的质量保证  FVIII 制品的生产过程严格按GMP 规定的要求执行，质量保证体系包括： 生产过程有效性验证，生产过程的监控和取样检测，以及产品交付临床使用前的检测。 成品的检测除常规的理化和生物学检测外，还包括rFⅧ特性的确定，如用加和不加凝血酶的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE ) 进行多肽分析，凝血酶裂解前后的逆相高压液相层析，FVIII:C 测定等。 安全方面的特定检测项目包括CHO 蛋白、纯化时使用的单克隆抗体蛋白、DNA 及其他混杂物质的残存量测定，必需低于预定的标准。(2) 基因工程FVIII 制品的临床应用   美国两家公司( Baxter 和Miles ) 生产的基因工程FVIII 制品，自1988 年开始临床试验，1992 年末至1993 年初被美国食品和药品管理署( FDA ) 正式批准上市，供临床治疗血友病A患者出血使用。  至2004 ，年销售额已达20 亿美元，在临床使用的份额（提供的量）上与血源性凝血因子VIII 产品大约各占50 ％。 其疗效与血源性的FVIII 制品无异，至今未见传播病毒性疾病的报导，但产生抑制剂的发生率似比输注血源性FVIII 制品者稍高。（二）重组人凝血因子VIIa （rhFVIIa ） 1. 凝血因子VIIa 的分子生物学和生理学 FVII 是一种以单链前体形式存在的糖基化的维生素Ｋ依赖的丝氨酸蛋白酶，分子量为50kD ，由406 个氨基酸残基组成。而具活性的FVIIa 则是FVII 的152 位Arg 和153 位Ile 肽键断裂后形成的双链分子，其轻链为23kD ，重链为28kD ，二者以链间二硫键相连。 在凝血外源性途径中，FVII 占有举足轻重的地位。 当血管损伤后，人体内的组织因子（Tissue Factor,TF ）与血液中的FVII 接触并在Ca2+ 参与下结合形成FVII-TF 复合物，其中的FVII 被激活成VIIa ，血液中FVIIa 含量升高后，即触发一系列凝血反应，达到止血效果。2. 人重组凝血因子FVIIa 制品的 开发和临床应用 以往人们普遍认为，血浆FVII 水平升高，是除了纤维蛋白原浓度升高之外容易导致心、脑血管血栓性疾病的又一病危因素。  但研究表明，FVII-TF 复合物只形成于损伤部位局部，这就可以避免全身性血栓形成的可能性。在应用FVIII 、FIX 及凝血酶原复合物（PCC ）制剂治疗血友病患者的出血性疾病时，经常遇到的问题就是抑制剂的产生。 临床治疗这类血友病人的方法包括：①输注大剂量FVIII 或FIX ，②免疫耐受治疗，③输注猪FVIII 制品，④使用PCC 的凝血因子VIII 抑制剂旁路活性（Factor  Eight  Inhibitor  Bypass  Activity ，  FEIBA ）。  通常认为, FVIIa 在PCC 的FEIBA 治疗中起着关键的作用，应可用FVIIa 代替PCC 的FEIBA 治疗。 （1）rhFVIIa 制品的开发生产 Hagen 于1986 年获得FVII 的cDNA 克隆  丹麦Novo 公司生产的rFVIIa ，NovoSeven  由于rFVIIa 为糖基化蛋白，且富含半胱氨酸Cys 残基，故生产选用的表达体系为幼年仓鼠肾细胞（baby hamster kidney cells, BHK ）。   从细胞培养上清中提取到的是单链rFVII ，活性仅为rFVIIa 的４%。但在离子交换层析中，rFVII 会被自动激活成双链的rFVIIa ，激活的程度在一定程度上取决于层析介质单位体积所吸附的FVII 量，而激活的起始则源于那部分低活性的单链FVII 。 （2）rhFVIIa 制品的临床应用 NovoSeven 于1988 年开始用于临床 1999 年美国FDA 批准用于有抑止剂的血友病患者 1996 年，Novo 公司介绍了其rFVIIa （NovoSeven ）近10 年的临床应用情况。NovoSeven 为一种未添加任何人源性蛋白的冻干制剂。有279 名病人（254 名甲型血友病，13 名乙型血友病，12 名含抗FVIII 抗体的非血友病人）接受了输注治疗，总共涉及出血症状1270 次。开始主要治疗腹内及腹膜后严重出血病人，以后扩大至中轻度出血患者，多数为关节出血。止血的总有效率为80%-90%, 大手术的止血有效率为94 ％, 副作用极少。 输注剂量一般为75-100μg ／kg 体重，开始每2ｈ间隔给药一次，等已达到满意止血时，可使用维持剂量一段时间。最近（2005 ），美国的一个研究小组发表了用NovoSeven 治疗315 例非血友病患者的多中心结果评估报告： 37.8% 患者用于预防出血[大多为临近手术而有高度出血危险，国际正常化比值（INR ）＞1.5,  或aPTT ＞正常值上限2倍的患者]，62.2% 患者用于出血治疗。使用剂量分别为75.6μg/kg 和89.4μg/kg 。 rFVIIa 给药后，两组患者的INR 都显著降低（分别从2.81±2.10 降到1.34±0.64 , 从2.13±1.68 降 到1.34±1.14 ); 输血和血液产品的使用量减少到给药前的85.1% 。 在预防出血组，只有14.3% 的患者在手术后6小时内实际发生出血。 在出血治疗治疗组，52.6% 的患者在rFVIIa 给药后6小时内停止出血。目前，除了已广泛用于被批准的适应证，即有凝血因子VIII 或凝血因子IX 抑制剂的血友病患者和先天性凝血因子VII 缺乏患者的出血治疗外，rFVIIa 还成功试用于治疗包括获得性血友病患者、血小板病患者、肝病患者、外科和创伤患者的难以控制的、威胁生命的严重出血。成为一种非常有特色的治疗各类严重出血的基因工程药物。 * * 血管壁损伤导致血液和内皮细胞的接触在细胞表面，FXa 和FVa 结合TF 和FVIIa 复合物激活FIX 和FX 组织因子(TF) 被暴露，并和FVIIa 或FVII 结合，后者随后也被激活为FVIIa 凝血外源性途径的启动FXa/FVa 复合物将少量凝血酶原激活成凝血酶所形成的少量凝血酶激活FVIII 、FV 、FXI 和局部的血小板，FXIa 进而将FIX 激活成FIXa  放大相激活的血小板结合FVa 、FVIIIa 和FIXa 在激活的血小板表面，FVIIIa/FIXa 复合物激活FX “凝血酶爆发”导致纤维蛋白凝块的形成FXa 和FVa 结合，将大量凝血酶原激活成凝血酶， 即“凝血酶爆发”. 止血凝块的形成*