细胞培养 消化传代将培养液倒干净，加入PBS 轻轻冲洗以去除剩余培养液，然后加入胰酶，放置1至2min ，倒掉胰酶，放入37 ℃，仅靠剩余胰酶消化。如果消化有困难，可以加入EDTA 与胰酶协同作用。传代时，尽量避免吹打细胞，如果必须要吹打，动作要轻柔不要用力过猛并避免气泡出现，这些都对细胞有损伤。气泡对细胞的损伤表现在多个方面。a. 泡破裂的瞬间，与泡相连的细胞会受到相对较高的张力，这种张力的强度足以导致细胞膜的破裂；b. 当泡沫移动时，会对附着在上面的细胞产生牵引力，泡沫以不同的速度或向不同的方向移动所产生的剪切力也会导致细胞的损伤。c. 此外，气泡还可以导致与之接触的细胞与培养液的接触面积减少而营养不足。冻存与复苏选择生长状态良好，处于对数生长期的细胞冻存；防冻剂可使用5－10 ％的DMSO 或10 －15 ％的甘油；冻存液中加入高浓度血清可以提高细胞的存活率，可加至50 ％～100 ％，即可以使用纯血清加防冻剂作为冻存液。用无血清培养基培养的细胞，在复苏时可以离心以去除血清。冻存速率不得大于10 ℃／min ，最好为1 ℃／min ：使用冻存盒；4 ℃，30min ；－20 ℃，1h ；－80 ℃，过夜；c. 将冻存管用棉花、纱布和塑料泡沫严密包裹以达到良好隔温效果，可以直接放入－80 ℃过夜；d. 之后，细胞应尽快转入液氮。复苏时应迅速复温，缓慢稀释，并保证较高的细胞密度。稀释细胞时应缓慢加入培养液，加入10ml  培养液的时间应不小于2分钟。开始时应逐滴缓慢加入，稍后可逐渐加快。如果稀释速度过快，可因为渗透压的改变导致细胞存活率至少下降50 ％。DMSO 可以轻易透过各种合成的及天然的膜，包括橡胶和皮肤，可以将任何与之结合的物质携带透过皮肤（即使戴着橡胶手套）。因此处理DMSO 时应小心并尽量避免与有毒物质同时操作。复苏时应严格操作，避免污染：由于复苏时与有菌环境接触较多，如果操作不慎，污染的机会极大。因此在复温之后，应将冻存管浸泡在70 ％酒精中至少30s －1min ，在超净台内吹干后按复苏常规步骤处理。细胞的运输冻存运输使用干冰置于塑料泡沫盒中，处理得当，可以保存3天。一旦出现融解，细胞活力将急剧下降。将细胞冻存管严密包裹，所用塑料泡沫盒应该不小于300 × 300 × 300mm ，壁的厚度约为50mm ，内部空间为200 × 200 × 200mm ，这样大的空间需放入5kg 干冰。以最快的速度将细胞从液氮转入干冰中，否则细胞将以10 ～20 ℃／min 的速度升温。绝对不能让温度高于－50 ℃。到达目的地后，即可按常规复苏处理。活细胞运输细胞应该处于对数生长期早期或中期，状态良好。如果细胞密度过大，培养液会消耗过快，细胞也易于脱落。培养液应该加满，拧紧瓶盖，这样液体的晃动幅度就不会太大。严密封紧瓶盖边缘，用防震材料包裹培养瓶。即可运输。运输标签上应注明“易碎品”、“切勿冷冻”等字样。到达目的地后，可将大部分培养液倒掉，余留正常量的培养液继续培养。待细胞生长至可以传代时，换新的培养液。一般不要立刻更换新培养液，以免细胞不适应。污染与防治对于一个刚刚接触细胞培养的人，其所面临的最大难题之一就是防止污染。而即使是经验丰富的研究人员，有时也难以避免污染。操作技术方面：a. 工作界面和设备不洁－－经常清洗工作区域并消毒。b. 培养液溢出到瓶口或超净台－－经常用75 ％酒精擦拭超净台；转移液体最好使用一定的移液设备（注射器，吸管等）；及时擦拭溢出物。c. 拿吸管时位置过低，接触瓶口或瓶塞内部－－正确握持吸管，不要在敞开的器皿上方操作。d. 拿取物品的操作不规范－－应注意拿取注射器、吸管、培养瓶、皿等的规范操作。所有无菌物品的操作都应处于视野之内，以避免无意识的污染。d. 向污物缸内倾倒液体时位置不正确（过低）－－保持一定高度；在污物缸上加一个漏斗；使用负压抽吸装置。e. 皮肤的分泌物或附着物掉落到培养器皿中－－戴橡胶手套；不要在敞开的器皿上方操作。为避免在敞开的器皿上方操作，应注意以下方面：1. 培养无菌意识，及时将培养瓶盖、离心管盖拧好，将培养皿盖好；2. 合理摆放超净台内的物品，避免不必要的操作经过敞开的器皿上方。建议：不要一次性把过多的物品拿入超净台；台内物品以操作者为中心成弧形摆放，酒精灯放在与操作者正对的位置，左手使用的物品放在左边，右手使用的物品放在右边；哪只手向污物缸内倒液体，就将污物缸放在哪边。f. 工作台内的灰尘和溢出的液体－－在工作前，工作后都要用70 ％酒精擦拭台面，工作中溢出的液体要立刻用70 ％酒精擦拭干净。总之，规范的操作和良好的习惯可以最大限度的避免污染，也是细胞培养最基本的技术要求。要经常注意向有经验的细胞培养人员学习良好的操作习惯。培养用耗材培养用液a. 未灭菌的试剂－－高压或过滤除菌。b. 物品储放区不洁－－经常清洁并作灭菌处理。c. 消毒过程不标准－－检查高压灭菌器是否工作正常；过滤后检查滤膜是否破裂；灭菌后的液体仍需做无菌试验。d. 一次性无菌用品不合格－－进行质量检测或更换供应商。取材：原代组织来源有污染－－不要把动物带入培养室处理；可能有污染的组织应在酒精中浸泡30s －1min ，在清洗用的PBS 中加入抗生素。玻璃器皿a.  储存时灰尘或细菌孢子进入－－消毒后的器皿应严密包裹，置于无菌物品专用放置区；未包裹物品放置不得超过24 小时。b.  高压灭菌不彻底（一次放入物品过多或放置不正确，瓶盖拧得过紧等）－－正确摆放高压锅内的物品，保持瓶盖微松。培养瓶及培养用液瓶灰尘或细菌孢子－－细胞拿出超净台时应拧紧瓶盖；任何物品在进入超净台前都要用酒精擦拭；怀疑污染者应作无菌试验，一旦证实，应重新消毒或丢弃。设备和工作环境空气空气的涡流，灰尘和气液混和物等－－经常打扫、消毒，尽量减少工作区内的活动，与培养无关的工作不要在培养室内进行。超净台a. 滤网破裂－－经常检查滤膜是否有破裂。b. 滤网需要更换－－检查透过滤网的风力是否正常。c. 溢出的液体进入工作台下层或缝隙中－－经常全面清洗消毒工作台，让酒精进入缝隙。CO2 孵箱a.  霉菌和细菌的生长－－用清洁剂清洗并用75 ％酒精消毒；培养瓶在放入孵箱前应用酒精擦拭。b. 开关孵箱时空气流动带起的细菌孢子－－开孵箱前要用酒精喷手；在孵箱的水盒中加入杀菌剂。昆虫－－严密包裹各种消毒物品；尽量不使用木制器具，如果使用了木制器具，应堵塞其上的缝隙并经常用杀虫剂清洗；不要将实验动物带入培养室。谢谢! * *