凝血酶调节蛋白与血栓性疾病中山大学第二附属医院　　马丽萍抗凝物质----- 启动蛋白C(protein C ，PC)  抗凝途径的重要辅因子通过与凝血酶结合形成TM- 凝血酶复合物参与机体抗凝和纤溶，与血栓形成有着密切的关系TM 的概况1960 年，Mammen 发现含凝血酶血浆具有抗凝作用1976 年，Stenflo 证明这种抗凝物质是蛋白C 如何？PC APC 1981 年，Esmon 首先从兔肺中分离出纯化TM 激活蛋白C 1984 年，Salem 分离人胎盘TM  1986 年，Jacubowski 分离牛TM  1988 年，Kumada 分离鼠TM  1987 年，Jackman RW 将人TM 的cDNA 分离、测序重组人TM 合成PC 的抗凝途径经典试验纯合子PC 缺乏-------- 新生儿爆发性紫癜杂合子PC 缺乏-------- 一部分患有血栓PC 水平减少----------DIC 有关（DIC 指标）TM 的结构由557 个氨基酸构成的、不具备内在酶活性的1型跨膜糖蛋白胞外区----496 个氨基酸1-226 个氨基酸组成的第一区域227-462 个氨基酸组成的第二区域，由6个表皮生长因子(ＥＧＦ) 样结构区（1——6 区）组成的重复序列组成富含丝氨酸/苏氨酸的第三区域，第6个EGF 分子区和跨膜区域之间跨膜序列----23 个氨基酸含2个半胱氨酸的单链跨膜区域，即第四区域胞内区----38 个氨基酸为一短的尾部，即胞浆区或第五区域TM 五个区域（功能上）第一区域---- 不参与激活活化蛋白C的过程，但为受体介导的胞吞所必需，参与内皮细胞在肿瘤生长和炎症过程中的调节第二区域----4 －6区有重要的钙离子结合点，为蛋白C活化所必需第三区域---- 附加硫酸软骨素部分对TM 与凝血酶的结合起稳固作用第四区域---- 人血尿中有活性的TM 可能来源于分解的跨膜成分第五区域---- 胞浆区，与TM 的内吞和降解有关Transmembrane Cytoplasmic  Rich Ser/Thr EGF-Repeats  Lectin Like  ⑤④③Ca ②①PC Activating  Thrombin  Binding  COOH NH3  Plasma Membrane TM 的结构和cDNA 克隆示意图TM 的合成和表达血管、淋巴管的内皮细胞人胚胎组织中的合体滋养层细胞中性粒细胞、单核细胞、血小板、间皮细胞血、尿、关节组织---- 以维持血液、淋巴液、滑液呈液体状态，以防凝块TM －凝血酶复合物如何结合？内皮膜上的TM 与凝血酶有很强的结合力，以1：1的比例形成TM －凝血酶复合物TM 上的硫酸软骨素部分，提供另一个参与PC 活化的凝血酶结合位点，可增加TM 与凝血酶的亲和力10-20 倍TM －凝血酶复合物的形成使凝血酶构型发生改变，在钙离子参与下，特异结合蛋白C，发挥TM 的抗凝作用由于TM －凝血酶复合物的形成，抑制了凝血酶与纤维蛋白原和蛋白酶激活受体-1 （PAR-1 ）的相互结合由于TM －凝血酶复合物的形成，遮盖和抑制了血小板上的凝血酶受体，抑制血小板与内皮的黏附和聚集Thrombomodulin  protein C TM 的功能加速蛋白C的激活：作为强的蛋白C激活物，TM 能使依赖凝血酶的蛋白C活化过程加快两个以上的数量级。降低凝血酶的功能：TM 介导调控体内重要的两种抗凝机制抑制凝血酶的促凝结构------ 因微血管系统富含TM ，这种环境下所产生的凝血酶绝大部分都被TM 包围或分隔减少凝血酶的生成------ 大量激活蛋白C（APC ）的形成使Ⅴa 和Ⅷa 水解加速，抑制凝血酶过多地产生对纤溶的作用TM －凝血酶复合物能活化凝血酶激活的纤维蛋白降解抑制物（TAFI ）。单链尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA ）也已被证实是TM －凝血酶复合物的附加底物，进一步肯定了TM 在纤维蛋白降解过程中具有广泛的作用。TAFI 与蛋白c竞争性的与TM—凝血酶复合物结合，形成了一个分散的表面。TM 的其它功能通过生物学、结构学、基因工程分析等研究发现，TM 不需要与PC 、TAFI 或凝血酶结合，也能发挥某些其它的生物功能，但必需通过血凝素样分子和EGF 区域来介导。抗肿瘤、抗炎症、稳定胚胎发育过程等TM 基因多态性与人类疾病●TM 基因多态性与血栓和动脉硬化的关系－133C/A 多态性----- 心肌梗死（MI ）－33G/A 多态性-----MI 或颈动脉硬化A25T 多态性----- 使MI 的危险性提高EGF6 区Ala455Val 多态性---- 与MI 相关●TM 基因多态性与TM 的功能Arg385Ser 多态性（EGF 4 区）---- 使TM 的表达和TM 的辅因子活性减少EGF 4 区和5区域环间的突变---- 使TM 的抗凝辅因子活性减低甚至完全丧失del791-801,Arg246---- 第一个导致人类TM 功能完全丧失的基因突变，与血浆TM 浓度的减少（大约为正常人的50 ％）TM 和血栓疾病●老鼠服用TM 减轻凝血酶诱导的血栓栓塞（依赖TM ）注射抑制PC 活化的抗体加强凝血酶的效果●三种不同程度的TM 功能缺陷的小鼠完全TM 缺陷的小鼠由于胎盘发育缺陷而死于宫内表达50%TM 功能的小鼠不会引起小鼠自发性血栓形成，但会增加肺内纤维蛋白的形成而导致持续性的低氧症●TMPro mice （Glu387Pro 点突变基因小鼠）尽管TM 激活PC 的能力丧失，但只是轻度增加血栓形成的危险性TM 与其它附加的危险因素结合才可能参与或导致血栓形成●内皮细胞损伤时，局部TM 缺乏触发了凝血和血栓形成让野生型胚胎和TM 完全缺陷的胚胎干细胞进行杂交，生产出的鼠的血管内皮上有一不连续的表面，由TM 完全缺陷的区域和邻近的TM 正常表达的区域相互交替形成的血管内皮上，纤维蛋白沉积仅仅出现在TM 缺陷的地方。●内皮细胞中敲除TM 基因敲除TM 基因后不会影响胚胎发育，但活产的动物由于在动脉和静脉自发性血栓形成而导致多脏器损害，出生后短期内死于消耗性凝血病。TM 和动脉硬化●在动脉硬化损害区，内皮上TM 的局部缺失导致病变部位PC 活化受损血浆TM 的基础水平能够反映内皮细胞TM 表达，但它与动脉硬化疾病之间的关系不肯定局部TM 的增加是否对动脉硬化有保护作用不肯定●在血管再狭窄和静脉移植发生粥样硬化过程中，TM 对局部血管壁的病理改变可能起调节作用将逆转录病毒的TM 注入人为扩张的兔股动脉，可减少血栓负荷、血管壁膜再形成、炎症细胞的浸润和基质的退化，说明平滑肌细胞增殖受抑与TM 有关在内皮细胞中发现TM 可通过MAP 激酶/ERK 途径调节依赖凝血酶受体的胞间信号转导TM 和中风●有研究表明脑出血与血浆TM 水平呈负相关●与其他血管床比较，TM 在脑毛细血管的表达很低，可能是因为脑内某些区域缺乏TM 。●体外试验中脑血管TM 的表达可被星型细胞释放的TGFβ（转化生长因子）抑制，提示TM 可能影响星型细胞的功能，从而防止凝血酶诱导的神经细胞死亡。●动物研究显示用可溶性TM 治疗可极大地改善脊髓损伤的预后TM 目前研究状况●TM 作为内皮损伤指标的证据TM 与DIC TM 、VWF 、TF 的关系TM 与炎症和多脏器功能衰竭TM 与肿瘤●重组TM （ART-123 ）的临床应用细胞保护和抗炎作用DIC 抗血栓治疗●肝素治疗与TM 的关系●TM 的检测方法：抗原测定（TM 片段）活性测定谢谢！* * 凝血酶调节蛋白(thrombomodulin ，TM) 抗凝机制Ⅲ（TF ）Ⅹa 凝血酶凝血酶抑制（激活）纤溶系统内源外源Ⅻa ⅪⅨa Ⅷa ⅤⅦa Ⅹa AT-ⅢHC ⅡP C  APC  PS TFPI TM+ 凝血酶APC+ 钙离子+PS 降解Ⅴa 和Ⅷa  抗凝作用APC+ 钙离子+PS  降解Ⅴa 和Ⅷa  抗凝6 5 4 3 2 1 Protein C Receptor (EPCR)  Thrombin +Protein S Activated Protein C fibringen receptor?  platelet + 1.Physiological anticoagulation 2.Modulation of pro-inflammatory reponse 蛋白C途径模型Platelets Inflammatory cells IIa Va VIIIa Fibrinmonomer  X Xa Cellular TNFa IL1βX X X Quiescence  TF-Vlla X *Inactivation Inactivation AT  GAG  Endothelium TM-IIa Protein S  Prot C  APC Inactivation  X  X  X Vascular/proteins Fibrinogen Fibrinolysis Restoration of Capillary blood flow PAI-1  X  Protein Z ZPI Ischemia/infarction Site TPI TM 功能下降导致血栓形成*