血友病研究的进展安徽省立医院血液科吴竞生血友病是由于遗传性凝血因子VIII （FVIII ）和IX （FIX ）基因缺陷，造成血浆FVIII 和FIX 含量不足或功能缺陷，引起的一组终生出血的凝血障碍性疾病，包括血友病A（FVIII 缺乏）和血友病B（FIX 缺乏），属X性联隐性遗传疾病。西方国家血友病患病率为5-10/10 万人口，我国2.73/10 万人口。血友病治疗进展70 年代-有效替代治疗，致残率与死亡率，寿命由平均10 岁接近正常。80 年代-病毒灭活技术改进，替代治疗安全性，感染病毒性肝炎，爱滋病。90 年代-重组凝血因子广泛应用，提高疗效；避免抗体产生与易发生病毒感染的副作用。基因治疗在动物试验中获得成功,在人类的临床初步研究成果为血友病的根治带来曙光。如何进一步降低血友病患者的死亡率，致残率，出生率，提高患者生存质量是目前工作的重要任务。一．发病机制的研究FVIII 基因定位于Xq28 ，全长186kb ，由26 个外显子和25 个内含子组成。已发现约300 多种基因突变，基因型与表型密切相关。点突变，小的基因缺失引起轻度FVIII 缺乏。终止密码子，大的基因缺失，插入，移位，无义突变往往引起严重的FVIII 缺乏和临床表型。FVIII 22 内含子倒位突变引起FVIII 严重缺乏是45% 的重型血友病A的分子发病机制。最近在1% 的重型血友病A中还发现FVIII 内含子1倒位突变。二．基因诊断（一）直接基因诊断：确定致病基因；携带者检出和产前诊断。采用PCR ，DGGE ，SSCP ，DNA 测序等方法直接测定致病基因的缺陷。FVIII 22 内含子倒位分析可作为重型HA 的筛选试验，是目前唯一用于临床诊断的直接基因检测方法。FVIII 22 内含子倒位和其它一些基因突变常伴有抑制物发生，因此有助于预测抑制物的产生。（二）间接基因诊断利用致病基因内外的限制性片段长度多态性（RFLP ）作为特异分子遗传标志物，通过家系成员间的连锁关系确定血友病基因的遗传情况，进行DNA 多态性分析的遗传学诊断(RFLP ，VNTR ，STR 等方法)，联合多个RFLP ，诊断率达可达99% 。RFLP 分析的局限性：须具有先证者的标本；母亲系该多态位点的杂合子，联合多个RFLP 。（三）高危胎儿产前诊断妊9-12 周：绒毛膜活检获取胎儿DNA 。妊12-16 周：养水穿刺。胚胎植入前：早期胚胎（8个细胞），通过DNA 基因型和遗传表型确定胎儿性别，是否为血友病或携带者。妊18-20 周：胎儿镜下取脐静脉血，测定VIII:C/FVIII:Ag 。流产危险（约0.5%-1% ）。早期，无创性产前诊断：FACS 测定母体静脉血中的胎儿特异性单克隆抗体以确定胎儿性别。三．替代治疗目前最有效的治疗手段。主张尽早治疗，将凝血因子提高到止血水平，避免出血并发征，防止功能丧失。（一）人FVIII 浓缩物：近15 年随着病毒灭活技术的改进（干热法-HIV ，有机溶剂加表面活性剂方法-HCV ，二步病毒灭活法-HAV ），血浆筛选的规范化（PCR ），血制品的安全性大大提高，血源传播性疾病如肝炎，爱滋病发生率明显降低。FVIII 浓缩物中纯度：含FVIII 1-3U/mg ，每1U/kg 可使血浆FVIII 水平提高2% ，含VWF ，也可用于VWD 。体内半寿期为8-12 小时。副作用：病毒感染，抗FVIII 抑制物产生。高浓度：含FVIII 50-200U/mg ，利用层析技术制备，不含VWF 。超高纯度：含FVIII 3000U/mg ，利用离子交换层析或单克隆抗体技术制备，不含VWF ，用于FVIII 抑制物( 中高滴度, 10-30BU) 的治疗。（二）重组FVIII 浓缩物（rFVIII ）基因克隆技术表达，生物活性，半寿期与血浆FVIII 相似，安全，无病毒污染。价格昂贵，也可产生抗体。加拿大与爱尔兰几乎所有HA ，美国70% 重型HA 采用。主要用于重型血友病A和抑制物的治疗。第一代（全长FVIII ）：人体白蛋白为稳定剂。第二代（BDD ）：蔗糖为稳定剂，FVIII 无B区，但仍保留其活性，无免疫活性，更安全，有效。第三代：鼠单抗，不含人和动物蛋白。转基因方法生产的人血浆制品的产量将大幅度提高，有望满足全世界血友病患者的需要。（三）猪FVIII 浓缩物抑制物对猪FⅧ的亲和性比对人FⅧ亲和性差，不易与人FⅧ抗体发生交叉反应,，用于高反应型抑制物且严重出血患者的治疗。约30% 产生抗猪FⅧ抗体，造成耐药。开始足量，迅速降低抗体，抗体滴度<5BU ：50u/kg ；5-30BU ：75-100u/kg ；>30U ：100-150u/kg 。重组人-猪FⅧ混合物利用抗原性较弱的无B区的猪FVIII 序列替代人FVIII A2 ，活化的肽-A3 和C2 序列，以降低免疫原性与抗原性，可望成为治疗抑制物的新制剂。（四）FVIII 旁路制剂-不依赖FVIII/FIX 绕开内源性凝血途径，通过补充外源或共同凝血途径中所需的凝血因子同样可达到凝血终点。（1）凝血酶原复合物(PCC) ：含FII ，FIX ，FX 和FVII ，治疗HB ；FVIII 抑制物出血的治疗，75-125U/kg/ 次，有效率50-60% 。可引起血栓。（2）激活的凝血酶原复合物(APCC) ：用于产生抑制物的血友病A出血的治疗，有效率40%-60% 。50-75U/kg ，q8-12h 。血栓发生率为1%-2% ，反复大量使用，肝脏病，抗凝血酶缺乏时易发生，如用3-4 次无效，不应再用。1）重组激活的FVIIa (rVIIa) 直接或与受损部位的TF 结合成复合物,与暴露在激活的血小板表面带负电荷的磷脂结合后，直接激活FXa ；还可激活FIX FIXa ，促进凝血酶形成，使纤维蛋白原纤维蛋白，达到局部止血。这种酶促反应局限在细胞表面，可能降低了全身凝血活化和血栓并发症的危险。推荐剂量为90ug-120ugkg-1 ，静脉注射，q2-3h, 重复2-4 次，有效率80%-90% ，安全。注射局部可形成血栓性静脉炎，极少发生血栓与DIC 。主要用于抑制物，手术出血的治疗。五．其它治疗（一）DDAVP ( 弥凝Stimate) 1- 精氨酸-8- 血管加压素，介导FVIII ，VWF ，纤溶酶原激活物从内皮细胞迅速释放到循环中，释放的VWF 结合FVIII ，使FVIII 增高约2-3 倍。80 年代HIV 流行时在意大利广泛应用，避免生物制剂病毒感染，抗体产生。剂量：0.3-0.4ug/kg+30mlNS ，15-30‘iv ；ivgtt ；鼻饲。副作用：面色发红，心率加快，轻度头痛，鼻塞。适应征：轻型HA ，携带者和1型VWD 首选。重型HA 和2型VWD 无效。禁忌征：2B 型和假性VWD 。心绞痛，心衰，妊娠禁用。5岁以下儿童慎用。血友病治疗指南（Hemophilia 2003 ，9）1 接受血制品前：皮下接种甲，乙肝疫苗。2 轻型HA 首选DDAVP + 抗纤溶，避免血制品。3 HA 首选rFVIII FVIII ；HB ：rFIX ；避免PCC 。4 献血员常规查抗HIV ，HCV ，HBsAg ；混合血浆测DNA ，减少病毒污染。5 HA 发生抑制物25-28% ；HB 1-3% ，1/2 过敏反应。6 PCC 和rFVII 偶可引起血栓并发症。7 新鲜冰冻血浆含异凝集素，需血型相合；冷沉淀物含FVIII ，vWF ，Fg ，FXIII ，未经病毒灭活。 放射性同位素治疗血友病早期滑膜炎反复关节腔内出血刺激滑膜增生，炎性细胞浸润，释放溶酶体破坏软骨，引起滑膜炎症，形成血友病关节炎，影响受累关节功能，最终功能丧失，残废。积极治疗早期滑膜炎对于控制血友病关节残废具有重要意义。关节镜滑膜切除等手术治疗：患者痛苦，需麻醉，充足的替代治疗，费用高。近年国外广泛开展同位素治疗血友病出血性滑膜病变。优点：简单，损伤小，术后恢复快，只需少量替代治疗，费用低。上海，北京，佛山已有报道。原理与方法早期慢性滑膜炎的非手术治疗经验来自放射性同位素治疗风湿性关节炎。利用射线“切除”增殖的滑膜和血管，可减少关节出血率，促进功能恢复。采用32P 或188 铼关节腔内注射，放射性同位素引起关节中滑膜结缔组织纤维化，部分毛细血管闭塞，出血减少，延缓关节病变的进展。方法与适应征疗效：接近关节镜滑膜切除，约80% ，出血程度减轻，频率减少。适应征：关节反复出血，6个月内出血超过3次；无明显关节软骨及骨质破坏，关节功能I-II 级，替代治疗不能有效止血的血友病患者5 岁以下儿童慎用。存在问题：远期疗效？同位素的选择？病例的选择？（三) 血友病的继发性疾病病毒感染：1985 年以前多数接受浓缩物治疗的血友病患者感染HIV ，HBV ，HCV ，直至近几年献血员筛选及病毒灭活得到改善。1 肝脏病变：HCV ，HBV 感染发展成慢性活动性肝炎，慢性迁延性肝炎（50% ），肝硬化（10%-20% ），肝癌发生率高于一般人群30 倍。肝功能衰竭是血友病患者死亡重要原因之一。HCV 治疗同非血友病患者的肝炎，α干扰素+病毒唑，约1/2 获得长期缓解。国外对少数失代偿性肝硬化血友病患者进行肝移植，移植的肝脏产生一定的FVIII/FIX ，血友病同时得到改善。2．获得性免疫缺陷病（AIDS ）1978-1985 年，90% 重型HA 感染HIV ，AIDS 成为血友病死亡的主要原因（占65% ）。HIV 感染引起继发性免疫缺陷，卡波氏瘤增加200 倍，非霍奇金淋巴瘤增加29 倍。1985 年以来，随着严格献血员筛选，病毒检测及病毒灭活技术（加热法，有机溶剂加表面活性剂，亲和层析法，二步法病毒灭活）的不断改进，现已基本消除感染HIV 的危险。治疗同其它非血友病AIDS 患者。二．伴有抑制物血友病A的治疗-- 个体化，经验性治疗FⅧ抑制物是临床最常见的引起出血的凝血因子抑制物,1940 年报告了首例获得性血友病。80 年代以前，伴有抑制物的血友病患者治疗棘手，死亡率较高。目前随着FⅧ“旁路制剂”的应用，使患者的预后大大改观。抑制物产生的流行病学与危险因素HA 患者接受含有FⅧ的血制品替代治疗后产生的特异性抑制或灭活FⅧ促凝活性的抗体，发生率占HA 20%-30% ，95% 的抑制物发生在中重型。抑制物产生的平均时间为暴露于抗原后50 天内（中位数9-11 天）。1/3 抑制物为一过性，无临床意义。80% 为高反应型。多发生于儿童（10 岁以前）。有阳性家族史，某些种族（如非洲人种），免疫应答反应强者发生抑制物危险性较高。抑制物产生与基因关系密切大片断基因缺失（30% ），无义突变（25% ）；22 内含子基因倒位和终止密码子引起FⅧ蛋白缺失（35% ），小的基因缺失，错义突变，剪切点突变致FⅧ蛋白存在, 但活性丧失，这种抑制物的发生率仅占5%-10% 。因此可见，基因突变类型可成为临床预测抑制物发生的危险因素之一。抑制物产生机制较重要的突变往往缺乏FVIII 抗原（CRM- ），重型HA 基本无FVIII 蛋白的合成与分泌，替代治疗的FVIII 则成为异体蛋白（抗原），诱导免疫反应，产生同种免疫抗体。轻中型HA 可合成和分泌无功能活性的FVIII 蛋白，部分患者可形成免疫耐受，抗体发生率低（3%-13% ）。但某些CRM+ 错义突变的轻中型HA 也可产生抑制物。抗体产生类型