1 血友病替代治疗疾病传播，费用昂贵基因治疗没有突破携带者及产前检查杜绝患儿出生、根治疾病血友病A 为例说明基因诊断的临床应用血友病携带者和产前诊断流程结果（1 ）内含子1 倒位机制内含子1 倒位检测方法间接基因诊断第一代标志( 参照国外）F8 基因内的BclⅠRFLP F8 基因内两个STR 位点F8 基因外的St14 VNTR 第二代标志（自主开发）6 个与F8 紧密连锁的STR 位点：DXS15 、DXS9901 、G6PD 、DXS1073 和DXS1108 距F8 1.5Mb 内1 个F8 内的STR 位点(F8Civs13) 性别位点为牙釉蛋白基因（Amelogenin gene ）终产物X 染色体102bp ，Y 染色体108bp 遗传连锁分析的多态性位点的相对位置特殊血友病A 家系的基因诊断先证者自幼皮肤、头颅撞伤后及拔牙及手术后有出血难止，曾发生过颅内出血BT 、PT 正常APTT 延长，FVIII:C 2% 输注全血或抗血友病球蛋白治疗有效先证者已故直接基因测序结果：携带者外周血DNA 直接测序未检测出突变原因：据文献报道FVIII 直接基因测序有1%-10% 的患者查不到基因突变（Hum Mutat. 2002 Oct;20(4):267-74 ）存在大的缺失? 内含子突变？携带者诊断结果间接诊断结果BclI 酶切图BclI 酶切图测序图间接诊断结果ca13 基因扫描间接诊断结果ca22 基因扫描血友病A 携带者间接诊断结果分析女性血友病A 的基因及产前诊断标本来源先证者（II-1 ），女，21 岁，汉族，自幼有踝关节及膝关节有自发出血，临床诊断为血友病A ，冷沉淀及浓缩FVIII 输注有效，因怀孕要求作基因诊断及产前诊断基因检测结果F8 内含子22 倒位F8 内含子1 倒位先证者阳性（携带者）阴性胎儿阴性阴性其他人阴性阴性先证者F8 基因所有外显子及其侧翼序列扩增测序（- ）遗传连锁分析发病机制先证者来自母系的X 染色体大部分被灭活，而来自父系的X 染色体保留活性家系其他成员及胎儿为X 染色体随机灭活发病机制先证者一条X 染色体发生了F8 基因内含子22 倒位，而未检测到其它F8 基因相关突变遗传连锁分析发现该女性患者的两条X 染色体分别遗传自其父母，排除其为单亲二倍体先证者的X 染色体灭活呈非随机性灭活，其遗传自父亲的X 染色体大部分保留了活性女性血友病A(2) 3637-3638insA 突变是如何产生的? 母亲外周血DNA 的F8 没有检测到基因突变母亲不同组织DNA F8 基因检测也没有检测到突变，不是体细胞的嵌和体患者3637-3638insA 自发突变（de novo ）框移突变(3637-3638insA) 间接诊断中的基因重组HA 家系情况先证者II-3 为重型血友病A 患者，F8C<1.0% II-5 要求作携带者诊断HA 家系遗传连锁分析的结果HA 家系检测结果22 倒位：均为阴性1 倒位：先证者（II-3 ）为阳性，女性（II-5 ）为携带者HA 家系诊断结果内含子1 倒位是该家系HA 发生的致病机制，II-5 为内含子1 倒位携带者遗传连锁分析发现II-5 在ST14 ，DXS15 ，DXS9901 ，G6PD 与DXS1073 ，F8Civs13 ，CA22 ，DXS1108 间发生染色体的同源重组结论在应用间接诊断进行HA 家系携带者及产前诊断时，不能仅使用单一的位点进行诊断，必须联合应用多个与F8 相关的位点来进行遗传连锁分析，尤其是F8 基因内的多态性位点2009 血友病基因诊断5 A 154 203 203 124 156 80 86 C 154 203 203 124 156 84 96 B 154 195 195 128 156 80 86 ⅠⅡ1 2 3 B 154 195 195 128 156 80 86 C 154 203 203 128 156 80 86 A 154 203 203 124 156 80 86 ？F8 F8 F8 F8 2Kb 1.5Kb 2Kb 1.5Kb III-1 表姐：-/- II-2 舅妈：-/- II-3 母亲：+/- II-4 父亲：+/+ III-2 待检者：+/+ M BclI 酶切识别位点T/GATCA 图a 待检者测序图，含BclI 酶切位点图b 表姐测序图，不含BclI 酶切位点a b III-1 表姐：144/144 III-2 待检者：142/142 II-3 母亲：142/144 II-2 舅妈：140/144 II-4 父亲：142/- III-1 表姐：79/79 III-2 待检者：79/83 II-3 母亲：83/79 II-2 舅妈：79/79 II-4 父亲：79/- 表姐舅妈父亲母亲待检者综合A13 、CA22 及Bcl I 信息，待检者与其表姐有不同的X 染色体舅舅？？119 164 1.9 20.65 12.5 40.1 II-3 107 142 2.8 18.8 11.5 39 II-2 2. 1 121 2.1 17.7 12.1 75.2 II-1 118 124 2.4 18.6 10 27.2 I-2 121 141 3.3 17.7 11.3 28.9 I-1 FVIII ：C % vWF % Fg g/L TT s PT s APTT s 319 218 150 282 340 172 374 323 212 150 282 346 172 365 319 218 150 282 340 172 374 325 220 150 280 340 172 374 325 220 150 280 340 172 374 319 218 150 282 340 172 374 325 220 150 280 340 172 374 323 212 150 282 346 172 365 325 220 150 280 340 172 374 HA 患者正常男性胎儿正常女性先证者图2 家系多态性位点遗传连锁分析图I II III 1 2 1 2 3 4 1 325 212 130 280 340 172 374 325 212 130 280 340 172 374 1337/2163 307/310 6475/6024 307/310 胎儿III-1 917 304 7122 304 弟II-3 3208/2166 298/310 6054/5233 298/310 妹II-2 1233/49 304/310 2543/2424 304/310 先证者II-1 285/135 298/304 1502/1183 298/304 母I-2 4083 310 7448 310 父I-1 Height Size Height Size HpaII 酶切后HpaII 酶切前家系成员女性血友病：(FVIII:C 3.4%,FVIII:Ag 4.2% Leu1975Pro 和3637-3638insA 父亲：(FVIII:C 6.9%, FVIII:Ag 7.4%), Leu1975Pro mutation J Thrombosis and haemostasis 2006 定量RT-PCR 显示：患者的FVIII mRNA 减少结论：女性血友病A 患者是其F8 基因中来自父亲的Leu1975Pro 突变和自发突变3637-3638insA ，双重杂合突变导致的一个血友病家系，父亲为血友病A ，儿子为血友病B 同时存在HA 和HB 患者家系的基因诊断HA HB FVIII (Xq28) FIX (Xq27) q p 染色体X 血友病A 、B ＋Result of phynotype detection 50-150 50-150 2.0-4.0 17±3 13±3 35±10 Reference range 1.9 75.8 2.3 16.2 12.0 90.0 III-7 98.1 139.0 2.8 16.3 11.6 36.6 II-8 82.2 98.0 2.1 19.8 12.5 39.9 II-7 98.3 0.3 3.2 15.3 12.2 88.0 II-6 68.4 145.0 2.5 17.0 12.5 40.6 II-3 78.3 154.0 2.5 16.4 12.1 39.5 II-1 94.4 128.0 4.3 17.0 14.0 42.5 I-4 104.7 149.0 2.8 16.8 12.3 37.3 I-3 FⅨ:C （% ）FⅧ:C （% ）Fg （g/L ）TT （s ）PT （s ）APTT （s ）Family member 基因诊断结果F8INV 22 ：父亲（＋）其他成员（－）F8INV 1 ：所有成员（－）F9 测序: 儿子mutation(32772A→T ，Ser365Cys), 母亲同位置杂合子阿姨、外公（－）父亲（－）Result of linkage analysis 399 340 208 166 313 365 399 340 208 166 313 365 399 340 208 166 313 365 399 340 208 166 313 365 389 336 210 164 313 358 395 350 212 180 313 358 395 350 212 180 313 358 395 350 212 180 313 358 ⅠⅡⅢ3 4 6 7 8 9 10 7 ？？＋：FIX 基因缺陷＋＋_ _ 外周血细胞、组织细胞外公体细胞、生殖细胞嵌合体外公阿姨Peripheral blood buccal cavity cells Enqomphesis rate :14.1% 嵌合体检测凝血因子V 和VIII 联合缺陷；常染色体隐性遗传性疾病；发病率为1/100 万，男女均可发病致病基因并非F5 ，F8 基因，而是与蛋白转运相关受体的编码基因突变导致：LMAN1 （70% ），MCFD2 （30% ）分子发病机制研究F5F8D 家系基因诊断F5F8D 家系基因诊断(1) 先证者1 ：10 岁女孩，口腔粘膜反复出血患者母亲怀孕要求做产前诊断F5F8D 家系基因诊断(2) 先证者2 ：50 岁女性，贫血，凝血功能不佳，长期痔疮出血先证者3 ：47 岁女性，凝血功能不佳F5F8D 家系基因诊断(4) 先证者4 ：50 岁男性，平时无明显的凝血功能异常现象，因痔疮出血难止于术前进行凝血功能筛查19.6 14.5 18.3 74.6 3 15.7 9.4 18.2 70.3 4 25 7.6 22.1 71.6 2 24.2 9.1 19.6 82.2 1 FVIII:C % FV:C % PT s APTT s 先证者F5F8D 家系实验室检测结果F5F8D 家系基因检测结果先证者1 ：LMAN1 ：Exon8 nt925-933insA 305frameshift 编码20 个氨基酸后终止LMAN1 ：Exon11 nt1387C>CT(X71661.1) 456Arg>Stop 母亲父亲产前诊断：胎儿为女性，且携带了来自父亲的突变先证者2 、3 ：MCFD2 ：Exon4 nt501T>C ，导致第136 位氨基酸错义突变，136 Ile>Thr F5F8D 家系基因检测结果F5F8D 家系基因检测结果先证者4 ：LMAN1 ：Exon5 nt636C>T ，导致202R>Stop 先证者4 之子（杂合子）：LMAN1 ：Exon5 nt636C>CT ? * * 王学锋FVIII (Xq28) FIX (Xq27) q p 染色体X 血友病A、B PCR 扩增外周血DNA 抽提（携带者）直接核酸测序间接联锁分析明确诊断长链PCR 检测内含子1,22 倒位血友病A ①、②、③羊水DNA 抽提（胎儿）①③②FVIII (Xq28) FIX (Xq27) q p X 染色体血友病A 、B 内含子22 倒位内含子22 倒位检测结果2Kb 1.5Kb 2Kb 1.5Kb 血友病A 家系15 Bcl I RFLP 位点多态性连锁分析家系13 st14 位点VNTR 多态的基因连锁分析内含子13 中STR 多态位点用于家系12 基因连锁分析147/ 147/147 145/147 149/ 147/149 147/149 145/147 147/ 国外：4 个位点2 个STR （CA13 、CA22 ），2 个SNPs （BcI I 、Hind Ⅲ）诊断率约为80 ％(Hemophilia. Chapman & Hall, London , 63-74) 中国人：用上述4 个位点信息量仅为27%(Clin Chem Lab Med 2001;39(12):1204 －1208 ) 间接诊断——血友病A 新位点的探索F8 F8Civs13 DXS1073 G6PD DXS9901 DXS15 DXS1108 ST14 CA22 所用STR 位点在正常人群中检测的结果STR 位点片段长度(bp) 不同等位基因的数目等位基因频率(%) 期望杂合度(%) 观察杂合度(%) DXS 15 145~ 164 10 0.59~37.87 74.97 88.24 (45/51) DXS 9901 186~ 214 12 0.59~37.87 79.77 82.35 (42/51) G6PD 168~ 188 6 0.59~52.07 56.06 21.57 (11/51) DXS 1073 120~ 138 9 0.59~49.11 59.92 62.75 (32/51) DXS 1108 76~96 4 0.59~73.37 39.97 35.29 (18/51) F8Civs13 152~ 168 6 0.59~69.82 47.61 52.94 (27/51) 第三代标志（自主开发）对象：69 名正常女性、31 个HA 家系（120 名成员）方法：人类基因组数据库中选择了位于F8 基因两端0.5CM 内的3 个STR 位点（5_226 、5_147 及3_486 ），F8 基因内的1 个STR 位点（INTRON25 ）及距离F8 基因2CM 内的DXS8069 位点，以多重荧光PCR 法检测5 个微卫星位点的多态性F8 CA22 DXS1073 G6PD DXS9901 DXS15 DXS1108 ST14 F8Civs13 F8 Intron25 DXS1073 5-226 F8Civs13 3-486 5-147 DXS8069 64.52% 6 72.46% DXS8069 58.06% 6 49.27% 3_486 41.94% 3 31.88% INTRON25 54.84% 6 49.27% 5_147 80.65% 12 72.46% 5_226 单独可诊断率多态性杂合度Marker 联合5 个STR 位点可对所有要求做携带者及产前诊断的血友病A 家系提供遗传连锁分析结果且与F8 基因直接检测结果相符结果与讨论7 重荧光PCR 技术降低重组发生率未见漏诊和误诊诊断率和准确率100 ％F8 Intron25 DXS1073 5-226 F8Civs13 3-486 5-147 DXS8069 家系1 家系2 FⅧ:C 2% 携带者及待检者F8 内含子22,1 倒位均为阴性2Kb 1.5Kb 2Kb 1.5Kb Sheet3 Sheet2 Sheet1 图表2 图表1 N III-1 II-1 II-2 % of normal control SD 00.00 .00 0.00 .00 00.00 .00 0.00 .00 异位表达量的比较relative mRNA expression level mRNA相对表达量的比较relative mRNA expression level % relative mRNA expression level mRNA相对表达量的比较N III-1 II-1 II-2 00.00 .00 .00 0.00 .00 .00 00.00 .00 .00 0.00 .00 .00
下载此电子书资料需要扣除0点,
