第十三章基因治疗原理与研究进展根据靶细胞不同，基因治疗分为：体细胞( somatic cell) 基因治疗生殖细胞( germline) 基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代基因治疗的概念将某个遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的方法。  第一节基因治疗的策略基因治疗的两种方式基因治疗的方式直接体内疗法（in vivo ）是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。2. 间接体内疗法（ex vivo ）是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。2. 逆转录病毒介导的基因转移系统2. 逆转录病毒介导的基因转移系统Retroviral packaging system 3. 逆转录病毒载体的特点逆转录病毒结构基因gag、env 和pol 的缺失不影响其他部分的活性。包装好的假病毒颗粒易于分离制备。逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。前病毒通过LTR 高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。AAV 的特点●以潜伏感染为主；●AAV 可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。第三节基因干预二、RNA 干扰（RNA interference ，RNAi ）由双链RNA 介导的细胞内特异性mRNA 降解过程，导致靶基因的表达沉默。四环素抗性操纵子系统原理四环素抗性基因的转录受Tet 阻遏蛋白的负调控。无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达。四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。。第一例基因治疗－腺苷脱氨酶缺乏症生理：腺苷脱氨酶是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。病理：腺苷脱氨酶缺乏－脱氧腺苷不能脱氨－脱氧腺细胞内堆积－淋巴细胞死亡－机体免疫功能缺乏。治疗基础腺苷脱氨酶基因位于20 号染色体长臂1983 年腺苷脱氨酶基因被克隆应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达治疗步骤抽取病人骨髓，分离淋巴细胞将病人淋巴细胞与携带腺苷脱氨酶基因的逆转录病毒载体混合培养，使腺苷脱氨酶进入淋巴细胞清洗淋巴细胞，去除多余病毒载体。应用抗性基因等方法选择阳性细胞，检测细胞内外腺苷脱氨酶含量治疗步骤确定腺苷脱氨酶在淋巴细胞有满意表达后，将带有此基因的淋巴细胞输回患者体内密切观察病人各项免疫指标的变化，必要时加以调整和重复经如上治疗后，患病女童免疫功能基本恢复。以后又连续进行了多次输入逆转录病毒载体+FⅨcDNA 重组体5’LTR FⅨneo SV PSO LTR 3’①导入仓鼠细胞（CHO ）→FⅨ表达；②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→FⅨ表达；③91 年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5% 。是我国基因治疗成功的例子。第六节基因治疗的问题与展望安全性问题1999 年首例基因治疗失败事件只限于体细胞，提倡间接体内法、主要用于单基因遗传病治疗、疗效显著并经过动物实验验证等。社会伦理问题禁止用于生殖细胞防止不当应用（如体育上）技术问题目的基因及调控元件选择安全高效载体构建及转移技术靶细胞选择BALB/c 裸鼠乳腺癌移植瘤动物模型的建立BALB/c 裸鼠移植瘤的抑瘤实验BALB/c 裸鼠移植瘤治疗结束后的肿瘤体积RT-PCR 检测肿瘤组织HSVtk 的表达水平目的要求：掌握：基因治疗的基本策略及常用载体。熟悉：基因转移的基本技术；基因干预的常用方法；治疗基因的受控表达原理与方法。Tet-Off 系统中，Tet 控制的转录活化子（tTA ）是野生型Tet 阻遏蛋白（TetR ）与一活化蛋白（AD ）的融合体。Tet-On 系统中，TetR 中四个氨基酸变化使其结合特性变为方向（rTetR) 。第五节基因治疗的应用研究1．腺苷脱氨酶( ADA) 和嘌呤核苷磷酸化酶( PNP) 缺乏症2．珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病3．血友病和其他血浆蛋白缺乏症4．苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病5．莱-纳( Lesch-Nyhan) 综合征6．家族性高胆固醇血症7．囊性纤维化病一、遗传病的基因治疗研究ADA 缺乏症French Anderson (NIH) LTR ADA SV40 neo LTR September 14, 1990 基因治疗的临床应用Ashanti de Silva Ashanti was the first patient to be treated with gene therapy. Injections repeated 7 times in first 10.5 months ADA: 1% 25% 乙型血友病薛京伦( 复旦大学) 1991, 皮肤成纤维细胞Factor IX: 5% 二、恶性肿瘤基因治疗研究常用基因治疗策略：基因增补基因干预技术自杀基因治疗—分子化疗肿瘤的免疫基因治疗。提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。（三）病毒性疾病的基因治疗研究可用基因治疗的策略1．调节机体免疫应答2. 基因干预，抑制病毒复制重组载体pRevTRE/HSVtk 构建流程基因治疗应用实例------- 乳腺癌的自杀基因治疗研究MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞株的建立A ：DMEM 组；B ：GCV+Dox 组；C ：GCV+ 病毒组；D ：Dox+GCV+ 病毒组M: 100 bp Marker ；1 ：DMEM 组荷瘤裸鼠肿瘤；2 ：GCV+Dox 组荷瘤裸鼠肿瘤；3 ：GCV+ 病毒组荷瘤裸鼠肿瘤；4 ：Dox+GCV+ 病毒组荷瘤裸鼠肿瘤4. 逆转录病毒载体的主要缺点随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb 以下的外源基因。（二）腺病毒( adenovirus，AV) 载体（二）腺病毒( adenovirus，AV) 载体腺病毒是一种大分子(36 kb) 双链无包膜DNA 病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒的优点1.基因导入效率高；2.宿主范围广；3.基因转导与细胞分裂无关；4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb 外源基因。腺病毒载体缺点2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3.有两个环节可能产生复制型腺病毒：载体与辅助细胞或患者体内野生型病毒发生重组。4.靶向性差。1.不能整合到靶细胞的基因组DNA 中。治疗基因表达时间相对较短。（三）腺病毒相关病毒载体AAV Virus Particle 腺病毒相关病毒( adenovirus associated virus ，AAV) 是一类单链线状DNA 缺陷型病毒。其基因组DNA 小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV 不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。Structure of AAV Virus Genomic DNA REP: 病毒复制基因, CAP: 编码衣壳蛋白的基因ITR ：反向末端重复序列AAV 载体的缺陷：可能会引起免疫排斥。感染效率比逆转录病毒载体低。在40%-80%的成人中存在过感染，AAV 载体容量小，目前最多只能容纳5 kb 外源DNA 片段；常用基因治疗载体整合特点安全性感染细胞克隆容量逆转录病毒载体随机整合，效率高可能致病分裂细胞<7kb 腺病毒载体不整合，可能丢失安全性较高分裂细胞、非分裂细胞腺相关病毒载体定点整合安全性较高分裂细胞、非分裂细胞<5kb <7.5kb 二、非病毒载体介导的基因转移系统（一）脂质体介导的基因转移技术基本原理：利用阳离子脂质体单体与DNA 混合后，可以自动形成包埋外源DNA 的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。脂质体介导的基因转移示意图（二）受体介导转移技术将DNA 与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA 具有靶向性。受体介导转移技术示意图（三）基因直接注射技术如：肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ。一、反义RNA 二、RNA 干扰三、核酶一、反义RNA （一）反义RNA 与基因表达调控主要指能与特定基因mRNA 互补结合的一类RNA, 可抑制一些有害基因的翻译。反义RNA 的关键技术问题：反义RNA 进入靶细胞前的降解问题专一性转移问题：解决举例: 将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP ）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL 复合物，成为运载核酸的工具。可以专一性地使反义RNA 特异进入肝细胞。（二）受体介导反义RNA 技转移术①受体介导的RNA 转移十分专一，而且效率高；②被转移的RNA 是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。借助前述的受体介导基因转移方法，可以实现受体介导的反义RNA 转移。（三）反义RNA 的应用前景（l ）安全性高（2）反义RNA 设计和制备方便（3）具有剂量调节效应（4）能直接作用于一些RNA 病毒（一）RNA 干扰机制示意图（二）RNA 干扰的应用前景1. 研究基因功能的新工具2. 肿瘤的基因治疗3. 病毒性疾病的基因治疗三、核酶( ribozyme) 具有酶活性的RNA ，可降解特异的mRNA 序列。与靶序列互补的区域保守区域（构成酶活性的结构域）核酶的作用机制（二）核酶的应用与一般的反义RNA 相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA 酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA 后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA 分子。第四节治疗基因的受控表达治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表达的时间、空间和水平三个方面。其策略大致有以下几种：基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件，例如酪氨酸酶基因。使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件，如甲胎蛋白( AFP) 基因。一、基因内部的调节机制二、基因外部的调节机制除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，比如对病灶局部进行热处理或电离辐射等，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。三、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。比如：肿瘤组织往往会出现葡萄糖缺乏或缺氧等微环境；炎症组织特殊微环境等。四、治疗基因的诱导表达为了防止其表达不再受外界控制，所以有必要开发和完善一些可诱导性