基因结构与表达分析的基本策略一、DNA 序列分析（一）双脱氧末端终止法(Sanger ,1977) （二）DNA 自动化序列分析（三）化学降解法(Maxam ＆Gilbert ,1977 ) DNA 合成模式图以DNA 合成反应为基础。（二）DNA 测序自动化原理1. DNA 自动测序步骤：4 种不同带有荧光染料标记的终止物ddNTPs 荧光信号采集、计算机分析与DNA 自动排序。二、核酸分子杂交（Nucleic Acid Hybridization ）●Southern 印迹杂交: 检测DNA （Southern EM ，1975 ）●Northern 印迹杂交: 检测RNA （Stark GR ，1977 ）核酸分子杂交原理（一）Southern 印迹杂交 (Southern blot hybridization) 将电泳分离的待测DNA 片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。（二）Northern 印迹杂交 (Northern blot hybridization) 指将RNA 变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA 分子的含量及其大小。可以对mRNA 进行定性和定量分析。（三）其他杂交技术1. 斑点杂交(dot blot hybridization ）2. 原位杂交（in situ hybridization ）三、Western 免疫印迹Western blot 原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸DNA 或RNA 片段。1. PCR 循环由三步组成：PCR 是模拟天然DNA 复制过程，利用DNA 聚合酶催化一对引物间特异DNA 片段合成的体外扩增技术。其主要热循环过程为：变性、退火、延伸三个步骤。3. PCR 扩增终产物大小: 介于两条退火引物5′末端之间的双链DNA 片段。4. 什么叫引物延伸产物？比两引物限定区长的延伸产物。仅发生在以原始模板DNA 为模板的扩增过程中，以倍数形式扩增(2n) 。（二）平台期与平台效应1. 平台效应（plateau effect ）：PCR 经过一定数量的循环后，DNA 片段不再呈指数累积，而是进入静止期即平台期。PCR 平台效应二）耐热DNA 聚合酶（三）高保真的耐热DNA 聚合酶（一）PCR 耐热DNA 聚合酶的发现（二）Taq DNA 聚合酶从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1 株中直接分离出来。1. 较高的热稳定性●95℃的半衰期: 40 min ●最适温度: 72 ℃～80 ℃●催化反应速率: 150 ～300 核苷酸/ 秒/ 酶分子Taq DNA 聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；●5′→3′外切酶活性；●逆转录酶活性；●较弱的非模板依赖性；●缺乏3′→5′外切酶活性。2. 无机离子及抑制剂Taq DNA 聚合酶的活性对Mg 2+ 浓度和单价离子（K+ 或NH4+ ）的性质和浓度较敏感。3. 保真性如何提高PCR DNA 聚合酶的保真性？①使用Taq DNA 聚合酶时，掺入少量具有3′→5′外切酶活性的耐热DNA 聚合酶, 错配率可降为原来的1/10 ；②使四种dNTP 底物浓度相等；③MgCl2 浓度尽可能低；④减少循环数。（三）几种高保真的耐热DNA 聚合酶1. Tth DNA 聚合酶2. Vent DNA 聚合酶3. Pfu DNA 聚合酶引物序列及其与模板特异性结合是决定PCR 反应结果的关键。1. 引物设计原则: ①引物长度: 10 ～30 nt 简并引物设计及应用：①对纯化的未知蛋白测定一段短氨基酸序列。②不同物种某一基因编码的保守氨基酸区域。4. 优化的引物设计实例上游引物序列：5′AGAACATGGTGCGCAGGTT3′下游引物序列：5′TGCCCATCATCATGACCTG 3′5′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCGGAGCCCAACTGCGCCGACCCC 3′四）PCR 条件的优化( 一) Taq DNA 聚合酶浓度：1.0 ～2.5 U/100 μL 反应液PCR 应用举例①遗传病诊断：镰状细胞贫血β6 Glu Val (GAG GUG) PCR 扩增β6 DNA 区域②传染病诊断：HBV 和HIV ③肿瘤分子标志诊断: bcr-abl PML/RARα④个体识别: 亲子鉴定与刑事侦破⑤生物考古五）PCR 改进技术（一）RT-PCR (reverse transcription PCR) 逆转录酶①鸟类成髓细胞性白血病病毒转录酶AMV （avian myeloblastosis virus ）酶活性最适温度42 ℃（二）定量RT-PCR （QRT-PCR ）PCR 扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。①选择内对照基因组织中普遍表达、表达量比较恒定的“管家”基因mRNA 。如GAPDH 和β-actin mRNA 等。（三）Real-time PCR ：PCR 扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。应用特异性荧光染料进行RT-PCR 的定量检测。②半定量标准计算PCR 产物：靶cDNA /GAPDH cDNA RT-PCR 验证药物诱导TNFαmRNA 表达上调12 h 24 h 48 h 72 h －+ －+ －+ －+ TNFαGAPDH 	③举例Y=A （1+E ）n Y: 扩增产物的量A: 最初靶DNA 分子数E: PCR 扩增效率n: 循环次数5. PCR 产量当E ＝100 ％, A=1 时Y=2n >>2n( 引物延伸产物的量）PCR thermal cycler Rotor-Gene PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳分析500bp 400bp 200bp 300bp 1000bp 600bp 700bp 800bp 900bp Markers PCR 产物2. 平台期影响因素：①引物及dNTP 底物浓度降低。②酶与模板比例下降。实际应用提示：定量PCR 应考虑平台期效应，选择最适循环次数。（二）Taq DNA 聚合酶（一）PCR 耐热DNA 聚合酶的发现2.T4 与T7 DNA 聚合酶: 热稳定性差。1. 大肠杆菌DNA 聚合酶ⅠKlenow 片段：①热稳定性差，不耐高温。②反应温度偏低，产生非特异扩增。3.Taq DNA 聚合酶: 实现了PCR 自动化基因全长:2,499bp 编码蛋白质: 832 个AA, 94 kD C 端结构域: 5′→3′外切酶活性N 端结构域: 聚合酶活性HOOC NH2 最适Mg 2+ 浓度：2 mmol/L K+ 浓度：50 mmol/L 1/41 000 －Taq DNA 聚合酶1/140 000 ± Klenow 片段1/190 000 ＋T7 DNA 聚合酶1/260 000 ＋T4 DNA 聚合酶核苷酸的错误掺入率3′→5′外切酶活性DNA 聚合酶三）PCR 引物及设计原则②碱基分布: A 、T 、G 、C 随机分布③G+C 含量：40 ～60% Tm=4(G+C)+2(A+T) ④引物之间：避免3′端互补⑤引物自身：不应形成二级结构⑦引物5′末端碱基: 可不与模板DNA 互补⑥引物3′末端碱基：最好选T 、C 、G ，不选A 引物5′端修饰技术附加核酸序列用途限制酶位点克隆（如定向克隆）噬菌体启动子合成RNA 探针、测序蛋白质结合序列产物纯化、检测核糖体结合序列高效表达加错配碱基造成突变定点诱变2. 简并引物（degenerate primers ）: 针对某一基因编码蛋白的氨基酸区域设计的一组碱基序列不同，但有相同碱基数的寡核苷酸混合物。应用：基于简并引物PCR 策略克隆新基因3. 引物设计缺陷而引起的后果GTCCAGTACTACTACCCGT AGAACATGGTGCGCAGGTT ( 二) dNTP 浓度：20 ～200 μmol/L ( 三) Mg2+ 浓度：0.5 ～2.5 mmol/L ( 四) 引物浓度：0.1 ～0.5 μmol/L 以mRNA 为模板逆转录合成cDNA ，再以此cDNA 为模板进行PCR 反应。RT-PCR 原理②莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶MMLV （Moloney murine leukemia virus ）：最适温度37 ℃半定量RT-PCR 以样本mRNA 为模板逆转录合成cDNA ，在不同引物对引导下共同PCR 扩增“管家”基因和目的基因cDNA 。克隆基因的酶切图谱分析基因组基因的定性和定量分析基因突变分析限制性片段长度多态性分析可以对DNA 进行分析。Southern 印迹杂交应用与Sorthern 印迹杂交的不同之处1. 样品的制备2. 凝胶电泳分离聚乙二醛和二甲基亚砜变性胶电泳甲醛变性胶电泳等3. 凝胶的处理步骤Northern blot hybridization 应用举例4.4kb 1.36 kb GAPDH 0d 2d 4d 6d 8d Northern blot 杂交分析mRNA 的表达靶mRNA 3- 磷酸甘油醛脱氢酶将RNA 或DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。用标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列杂交，可对核酸进行定性、定位和相对定量分析。Western blot 程序：●蛋白质样品制备●SDS-PAGE 分离●蛋白质转膜●标记抗体与膜上蛋白质抗原杂交●检测并分析标记物信号聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离小片段DNA( 1 -1000 个碱基对) 可以分离蛋白质Western 免疫印迹信号检测原理Luminol 化学发光原理Hours 0 4 8 16 另一种信号显示方法是在洗去一抗后，加入碱性磷酸酶标记的二抗，再用BCIP ／NBT 在膜上直接显色。三种印迹技术的比较四、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) 一）PCR 技术原理二）耐热DNA 聚合酶三）PCR 引物及设计原则四）PCR 条件的优化五）PCR 改进技术DNA 的生物合成（DNA 复制）一）PCR 技术原理DNA 复制引物：单链RNA 片段PCR 引物：单链DNA 片段PCR 技术发明核酸体外扩增最早的设想：1971 年，Khorana 等提出：“经过DNA 变性，与合适引物杂交，用DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因。”问题：测序难，DNA 合成难—引物合成难，1970 年，Smith 等发现DNA 限制性内切酶。1983 年春，Kary Mullis 提出DNA 反复复制的设想加热使双链DNA 模板变性为单链，降温使单链DNA 与引物结合（退火），加入DNA 聚合酶延伸引物合成新的DNA 。Kary Mullis 1984 年6 月，Kary Mullis 被公司限定一年内建立PCR 技术。同年8 月，Kary Mullis 在Cetus 公司提出PCR 原理的报告9 月，Kary Mullis 着手PCR 试验，结果不够肯定，凝胶电泳的条带若有若无。1984 年11 月，Kary Mullis 的助手取得可信结果。1985 年初，Saiki 的实验结果让人无从置疑。1985 年3 月申请专利。1985 年12 月20 日《科学》发表PCR 实验技术。1987 年初《酶学方法》发表PCR 原理。1993 年，Mullis 获得了诺贝尔化学奖。（一）PCR 基本过程http://www.book118.com/ddnalc/resources/animations/pcr.swf ①变性（denaturation ）②退火（annealing ）③延伸（extension ）2. PCR 原理：* Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes 分子生物学Molecular Biology 萧小鹃分子生物学研究中心分子生物学的三大核心技术DNA 序列分析—DNA 测序，1977 聚合酶链式反应—DNA 扩增，1985 DNA 重组技术—基因克隆，1973 ATP 、dATP 和ddATP 的结构ATP A OH OH H H dATP ddATP ( 一）双脱氧末端终止法（dideoxy chain termination ）掺入第N 个核苷酸DNA 合成反应掺入第N+1 个核苷酸H 末端终止部位DNA 单链模板引物延伸的新合成链