λZiplox 载体( 三) 黏性质粒（cosmid ）是由λ噬菌体的黏性末端（cos 区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA 。其克隆容量可达40 ～50 kb 。( 四) M13 噬菌体(M13 phage) 一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF ）。复制型M13 可用作克隆载体。( 五) 病毒载体逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB 病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322 的复制子组成。二、表达载体( 一) 原核表达载体表达载体中含有复制起始位点、抗性基因、克隆位点、启动子、核糖体结合位点和转录终止信号。multiple cloning site ( 二) 真核表达载体含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因. 还含有真核表达元件, 包括启动子、增强子、克隆位点、转录终止信号和poly (A) 加尾信号.  第三节基因克隆的基本过程基因克隆主要步骤：①制备目的基因和选择相关载体②目的基因和有关载体进行连接③重组的DNA 导入受体细胞④DNA 重组体的筛选和鉴定⑤DNA 重组体的扩增、表达和其他研究（二）从cDNA 文库中获得（三）PCR 扩增特定基因（四）人工合成一、目的基因的获得（一）从基因组文库中获得几种常用克隆载体的比较注：+ 表示可用；- 表示不可用比较内容质粒λ噬菌体黏性质粒M13 噬菌体克隆容量<10 kb <22 kb 40 ～50 kb <1 kb 基因组DNA 文库- + +  - cDNA 文库+  + -  - 亚克隆+  -  -  + 序列分析+  +  - + E.coli 表达+  + -  - 二、载体的选择与准备三、DNA 分子的体外连接（一）黏性末端（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（四）平端连接（一）黏性末端（二）人工接头（三）加入同聚体尾待克隆DNA 片段重组质粒混合、退火空白质粒（四）平端连接四、外源DNA 导入宿主细胞（一）转化（transformation ）（二）感染（infection ）（三）转染（transfection ）五、目的基因的筛选和鉴定外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR 等。（一）遗传学方法插入灭活法1. 2.  蓝- 白筛选（α互补）许多载体（如M13 系列、pUC 系列、pGEM 系列）都含有β- 半乳糖苷酶基因（lacZ ）的调控序列和氨基端145 个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β- 半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的β- 半乳糖苷酶，使人工底物X-gal 转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA 片段，将使lac Z 基因灭活，不能生成有活性的β- 半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。（二）免疫学方法如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。（三）核酸杂交法对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA 文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。菌落原位杂交的原理转化E. coli 并铺于琼脂平板上将膜放置平板表面定位、揭起变性、中和、固定杂交、洗膜、显影（四）PCR 技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。( 五)  酶切鉴定用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。第四节真核细胞转染一、真核细胞转染的方法与基本原理（一）磷酸钙沉淀法（calcium phosphate co-precipitation ）使外源DNA 或重组质粒DNA 与磷酸钙混合，形成微小颗粒，并加入到宿主细胞中，使这些颗粒沉积在细胞表面，以利于宿主细胞摄取这些颗粒。（二）电穿孔法（electroporation ）将外源DNA 与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多小孔，使外源DNA 能进入宿主细胞。*  第八章基因工程与体外表达Gene Engineering and Gene Expression 曾海涛中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心基因工程是指在体外对DNA 分子按照既定的目的和方案，对DNA 进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA 片段，表达有关基因产物，进行DNA 序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。第一节基因克隆的工具酶一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）从双链DNA 内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。限制性核酸内切酶的特点类型限制性修饰作用识别位点切割位点Ⅰ型有有特异识别位点下游100 到1000bp Ⅱ型有无特异可知、固定Ⅲ型有有特异识别位点附近切割DNA ，切割位点很难预测。2 ．限制性内切酶的命名EcoRⅠE 代表Escherichia 属co 代表coli 种R 代表RY13 株3 ．限制性内切酶的识别和切割位点通常是4 ～6 个碱基对、具有回文序列（palindrom ）的DNA 片段，大多数酶是错位切割双链DNA ，产生5ˊ或3ˊ黏性末端（sticky end ）。如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端：5  -GAATTC-3’5 -G AATTC-3  3  -CTTAAG-5’3 -CTTAA G-5  PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端：有一些酶沿对称轴切断DNA ，产生平端或钝端（Blunt end ）, 如SmaⅠ：5  -CTGCAG-3 5  -CTGCA  G-3 3  -GACGTC-5 3  -G  ACGTC-5  5  -CCCGGG-3 5  -CCC  GGG-3  3  -GGGCCC-5 3  -GGG  CCC-5 二、其他常用的工具酶1. DNA 聚合酶Ⅰ(DNA polymerase I) ●聚合酶活性●3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性●5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性2. DNA 聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)  DNA 聚合酶I 用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin) 裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow 片段（Klenow fragment ）。5ˊ→3ˊ聚合酶活性3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性Klenow 片段的主要用途有：(1) 补齐双链DNA 的3ˊ末端。(2) 通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。5ˊ-G-OH Klenow 5ˊ-GTT*A*A-OH 3ˊ-CAATT-OH d*ATP,dTTP 3ˊ-CAA T T-OH (3) 在cDNA 克隆中，第二股链的合成。(4) DNA 序列分析。3. 逆转录酶（reverse transcriptase ）一种RNA 依赖的DNA 聚合酶，即以RNA 为模板合成DNA ，合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。4. T4 DNA 连接酶（T4 DNA ligase ）催化双链DNA 一端3ˊ-OH 与另一双链DNA 的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同黏性末端或平端的DNA 两端连接起来。5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ）能去除DNA 或RNA 5ˊ端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。6. 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT ) 第二节基因克隆的载体载体是携带目的基因，使其在宿主细胞内复制或表达的DNA 分子。一、常用的克隆载体( 一) 质粒（plasmid ）是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA 分子。作为克隆载体的质粒应具备下列特点：（1 ）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。（2 ）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素抗性基因，β- 半乳糖苷酶基因（Lac Z ）等。（3 ）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。质粒一般只能容纳小于10kb 的外源DNA 片段。( 二)λ噬菌体噬菌体(bacteriophage, phage) 是感染细菌的病毒，用作克隆载体的噬菌体有两种。λ噬菌体M13 噬菌体*