Key lab of Medical College of Su Zhou University DNA Analysis By Flow Cytometry  核医学生物技术重点实验室基本原理概述正常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg DNA/ 细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA 含量。在细胞周期( G0，G1，S，G2 ，M) 的各个时期，DNA 的含量随各时相呈现出周期性的变化：在G1 期，细胞开始RNA 和蛋白质的合成，但DNA 含量仍保持二倍体；进入S 期后，DNA 开始合成，这时细胞核内DNA 的含量介于G1 和G2 期之间；当DNA 复制结束成为4倍体时，细胞进入G2 期，G2 期细胞继续合成RNA 及蛋白质，直到进入M 期，因此，单纯从DNA 含量无法区分G2 期和M 期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期( G0 期)，而G0 期从DNA 含量上同样无法与G1 期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M 期。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S% 及G2/M/%，了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S 期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。正常细胞具有较恒定的DNA 含量，而细胞癌变过程中结构和/或染色体的异常是很常见的。这种变化在流式分析中以DNA 倍体指数的形式表现出来，这一指数对于肿瘤的早期诊断，交界瘤、间叶组织肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指标。流式DNA 周期示意图样本制备来源于血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手术活检、细针穿刺物等的细胞都可用来做DNA 分析。新鲜的、冰冻或固定保存的、或常规固定/包埋用于组织检查的样本均可。通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。用组织切片的好处是可以通过观察常规染色来选择感兴趣的区域，缺点是不能再用抗体染色来鉴别肿瘤细胞和正常基质细胞。实体标本的单细胞制备机械法：用剪刀、刀片剪切组织或金属网研磨获取完整的细胞。但该法获取的细胞数量少。化学药品处理法：利用EDTA 或Sodium citrate 结合Ca2+ 或Mg2+ 等阳离子，破坏细胞间的连接或用Triton X-100、NP-40 破坏细胞膜。该法只能取得细胞核，且易出现核凝集。酶法：利用酶将细胞间的连接物水解，使细胞从组织中分离出。一般常用的为胃蛋白酶及胰蛋白酶。该法也只能取得细胞核。细胞浓度及质量要求单细胞和核的最终浓度应约106/ ml。浓度太低，上机时样本的流速不得不提高，这样就会影响检测的CV。浓度太高，则可能导致染料的相对不足，最终使染色不饱和，同样影响CV 和检测结果。制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量：细胞是否聚集或过多的碎片；大多数核有肿瘤样的外观(比如说，不是粒细胞)等。保证足够的肿瘤细胞含量；检测S% 时建议的最小可接受比例是20%。固定常用70%的冰酒精固定单细胞悬液。应保证样本完全浸没在固定剂中置40 C 冰箱固定4小时上。对于甲醛固定的组织切片，应注意甲醛会影响PI与核酸的结合。若同时使用抗体鉴别肿瘤细胞，应选择对抗原无损的固定剂。对许多细胞表面抗原来说，固定只能在抗体标记之后进行。染色染料的选择取决于流式激光的配置。488 nm 的激光下应用PI( 碘化丙啶)，由于PI 也与双链RNA 结合，所以分析前样本应用Rnase 处理。重要的是染料要足够，以保证饱和结合。PI 的推荐浓度是至少20 ug/106 个细胞。其最佳浓度为50 ug/106 个细胞。在室温<200 C 下避光孵育30分钟，3小时内上机分析。影响荧光染色的因素温度：温度高于200 C 时，即出现温度淬灭。PH：PI 在7.2~7.6，保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡。荧光染料浓度：染料太少，结合不完全。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合，造成荧光发射强度减弱。杂质：溴化物、碘化物、硝基苯、铁、银等，对荧光有淬灭作用。DNA 的参考标准样本的倍体是根据二倍体细胞峰的标准来计算的。临床标本中常常有一些正常的二倍体核存在，可用来作为标准。但问题是如何判断哪个峰是正常二倍体细胞。事先加入标准参照细胞(如鳖或鸡红细胞)会有助于判断。特殊细胞类型的特异性抗体标记也有助于检出肿瘤群体。标准参照细胞应尽可能早加入标本，与样本一起制备。DNA 检测(1) DNA 检测采用线性放大。应检查放大器的线性度(如用标准荧光微球、多倍体的肝细胞、有聚集体的固定的淋巴细胞、鸡和鲑鱼红细胞等)。(2)应每日通过检测标准微球或固定、染色的淋巴细胞的CV 来检查仪器调校情况，此CV 应<=2%。(3) DNA 直方图的道数值应至少为512。应以正常二倍体细胞的G1 峰位置来调节PMT 电压值：G1 峰道数应不低于最大道数的五分之一，即1024道时的200，512道时的100。(4)阈值应设在DNA 荧光参数上FL3 Peak 30-40。(5)所有的信号都应被收集，包括从二倍体G1 峰道数值1/10处以上的碎片。(6)收集的细胞总数应在DNA 直方图中足够提供10000个核(除外碎片)。DNA 直方图越复杂，需要收集的细胞数量越多。若需报告S 期数值，则S 期区域至少应有100个细胞。(7)为获得最佳CV，流速应保持在低速(通常100-300个粒子/秒)。多参数分析尽可能地显示FSC vs SSC 的双参数图。碎片常常能被区分开来，用设门去除。制备较好的标本中，炎性细胞常可以和肿瘤细胞区分。荧光素标记的抗体常被用来区分正常和肿瘤细胞。如上皮性肿瘤中可用抗cytoketatin 的染色来鉴定上皮细胞；在非淋巴细胞肿瘤中，正常的炎性细胞可用白细胞共同抗原CD45 来区别；淋巴性肿瘤中则可根据肿瘤的分类选择合适的细胞表面抗原。利用Ki67、PCNA 来鉴别G0 与G1 期、G2 与M 期。常用术语Coefficient of Variation(CV)：变异系数。不同细胞群体DNA 含量的细微差别可能有生物学上的重要意义DNA index(DI)：DNA 指数。DI 指的是肿瘤样本G0/G1 峰的平均荧光道数与正常人二倍体G0/G1 峰的平均荧光道数之间的比值。Ploidy：倍体。原指染色体数目。流式中用来描述总的DNA 含量。二倍体细胞有正常细胞的DNA 含量但不除外染色体异常。判断标准组织标本：DI=0.9~1.1 二倍体其余为异倍体。（DI：0.85~0.9 或1.1~1.15为近二倍体；DI>1.15 为超二倍体；DI<0.85 为亚二倍体。）但对于四倍体和G2/M 期的判断，一般用G2/M 占G0/G1 的20%以上即算四倍体。浆膜腔脱落细胞良恶性判断标准1.出现DNA 的非整倍体峰为恶性肿瘤细胞。2.无明显的非整倍体峰，但有一突出的四倍体峰和大于15%的S 期细胞，并伴有G0/G1 期CV 值大于9%为恶性肿瘤细胞。3.无明显的非整倍体峰，但G0/G1 期CV 值增大，并伴有大于10%~15%的S 期和一个突出的四倍体峰，诊断为可疑癌。结果报告报告中至少应包含以下信息：(1) DNA 倍体，包括所有群体的DI；(2) 主要G1 峰的CV；(3)S 期比例；(4)必要的简单评价：如细胞数的不足、碎片较多、CV 太高等。*  * G0/G1 静止期及合成前期S 合成期G2/M 合成后期及分裂期*  * *  * *