艾滋病的实验室检查及其临床意义 广州市第八人民医院传染病研究所唐漾波HIV 感染者/ AIDS 患者的诊断1 ．临床体检及病史资料的分析，可提供重要线索，筛选出可疑患者。2 ．HIV 感染的病原学检查，以确定是否感染HIV 。这是明确诊断的必备条件。3 ．对机体免疫功能的检查，尤其是CD4+ 细胞的测定，是诊断AIDS 的必备条件。  HIV 感染者/ AIDS 患者的诊断4 ．对机会性感染的病原学和病理学检查，以确认AIDS 的指针性疾病。如有复杂的表现不易解释和治疗，要考虑有机会性感染，通过活检、内窥镜、支气管肺泡灌洗（BAL ）、穿刺等手段采取标本作病理检查，借助特殊染色或免疫组化、免疫荧光技术、PCR 、原位杂交等技术检测病原体。5 ．对肿瘤（主要是卡波西肉瘤和淋巴瘤）的病理学检查，对确定AIDS 也很有必要。6 ．影像学检查，对患者的病变部位与范围进行确认与随访。 HIV 的实验室检查1 、HIV 感染的诊断 （1）检测HIV 的抗体成分（首要检测指标） （2）检测HIV 的核酸成分 HIV 血浆病毒载量（HIV RNA load ） （3）检测HIV 的抗原成分 （4）病毒分离培养2 、免疫功能的检查 （1）细胞免疫功能的检查 （2）体液免疫功能的检查 3 、机会性感染及肿瘤的诊断 （1）感染病原体的诊断 （2）感染部位病理学诊断HIV-1 的结构电镜下，成熟的HIV-1 病毒呈现为一高密度筒状核心及一个脂类病毒外壳。病毒表面是由72 个刺突组成的20 面体，每个刺突由3~4 个病毒表面gp 多聚体组成：gp120—外膜蛋白，gp41—跨膜蛋白，病毒内膜—p17 病毒核心是由病毒RNA （由两条完全同源RNA 链组成），病毒核心结构蛋白（p24Gag 蛋白）和病毒繁殖所需的酶蛋白（包括逆转录酶蛋白p66 ，p53 及整合酶）组成。HIV-1 复制周期HIV 主要抗原 gap 基因（核心基因）：聚合蛋白p55→主要核心蛋白p17 、p24 核酸结合蛋白p15 pol 基因（逆转录酶基因）：p64 、p53 、p31 env 基因（包膜基因）：gp160 （糖蛋白）→gp120 （包膜糖蛋白） gp41 （跨膜糖蛋白） 以上蛋白质均具有抗原性，可刺激机体产生相应抗体，其中p24 和gp41 抗原最有诊断意义 HIV 主要抗体 感染HIV 后一般于1~3 个月内产生抗体，由于HIV 抗原成分多，抗体种类也较多，出现时间不同。 出现最早： gap 蛋白（P24, P25 ）的抗体 同时或稍后出现： env 蛋白（gp41, gp120, gp160 ）的抗体 pol 蛋白（p66, p51,p31 ）的抗体 其中P24 抗原和抗体可能随疾病进展而下降gp41 抗体较稳定而持久，是HIV 主要的检测抗体HIV 感染的诊断程序：  HIV 初筛检测→阴性→发出阴性报告 ↓阳性 HIV 初筛检测→阴性→发出阴性报告 ↓阳性 HIV 确证检测 ↓阳性 确定HIV 感染诊断 血清HIV 抗体的检测1 ．HIV 初筛检测 （1）酶联免疫吸附法（ELISA ）方法：间接法、双抗体夹心法、竞争法特点：灵敏性99.5% ，特异性99.8% ，简便易普及。（2）斑点免疫胶体金快速试验（金标法）特点：快速、简便，但灵敏性、特异性均低于ELISA 。 结果不能作为诊断依据，仅供参考。  血清HIV 抗体的检测2 ．HIV 确证实验 （1）蛋白印迹（WB ）检测法方法：用已知的HIV-Ag （主要是gp160/gp120 、p41 、p13 、p24 ）检测待测标本中的HIV 抗体。HIV-Ag ：纯化的病毒蛋白质或基因工程抗原产物或人工合成的某段病毒多肽。特点：特异性高，不需活病毒作抗原，但操作较复杂。（2）其他：免疫荧光检测法（IFA ） 放射免疫沉淀试验（RIPA ） 条带免疫试验（LIA ）3 ．HIV 抗体检测的主意事项  HIV 抗体检测的阳性率受个体差异、病程进展、试剂敏感性和检测方法等许多因素的影响。（1）重复检验，或改用更敏感的方法检验。（2）定期复查：由于存在数周至数月的窗口期，需要于1.5 月、3月、6月查三次。（3）检测HIV-2 抗原或抗体。（4）病情严重病人或免疫严重缺陷者，可能不能检出抗体，需要直接检测HIV 抗原、病毒基因或病毒颗粒。 一．检测HIV 的核酸成分1. RT-PCR 技术：高效率、高敏感性、高特异性RT-PCR 定量技术：设置内参进行定量测定HIV RNA load2 ．bDNA 技术：利用分支DNA 信号扩增实验测定HIV RNA load 。特点：特异性强，能排除污染的干扰，敏感性弱低于PCR 技术3. 分子杂交技术：同位素标记的HIV RNA 探针 （三）HIV 抗原的检测1 、检测方法：双抗体夹心ELISA 法 p24 抗原捕获实验 优点：简便、迅速，并可定量 缺点：敏感性低于病毒培养或PCR2 、临床意义（1）窗口期的诊断：感染HIV 后约2周可检出HIV 抗原（抗原血症），持续约6~8 周；感染后1~3 月，抗体出现，抗原浓度下降。（2）晚期判断预后：若HIV 抗原再度出现伴p24 抗体下降或消失，表示病毒复制活跃，是病情恶化进展的标志。（3）判断新生儿是否感染HIV ：新生儿因含有母体输送的HIV 抗体（一般6个月内），需检测HIV 抗原以确定有无垂直感染。（4）可用来评价抗病毒治疗的效果。 （四）HIV 病毒的分离与培养 方法：从患者血液中分离淋巴细胞 ↓ 在含有T细胞生长的液体中培养 ↓ 用植物血凝素（PHA ）刺激T细胞，使其转化成熟。 检测上清液中的逆转录酶或抗原，在该酶达到高峰时。 上清液与含HIV 抗体的血清培养 ↓形成免疫复合物而分离病毒 ↓分离出的HIV 用脐血淋巴细胞培养传代 特点：对病因诊断具有重要价值 但操作烦琐复杂，技术条件要求高，且阳性率不高，难以在筛选中使用，目前主要用于病原学、流行病学及疫苗的研究。 二．免疫功能的检查 （一）血液细胞学检查 AIDS 血常规改变：（1）75-85% 的AIDS 有轻-中度贫血，Hb<100g/L （2）白细胞<400/mm3 (0.4x109/L) ，核左移现象。（3）外周血淋巴细胞明显减少，常<1500/mm3 （1.5x109/L ）或比例小于15% 。（4）血小板偏低，常低于10 万/mm3 。AIDS 血常规检测的临床意义：（1）WBC 的分类、计数及形态观察特别是淋巴细状况对评价免疫功能尤为重要。（2）监测抗病毒治疗过程中药物的毒副作用细胞表面标记细胞与介质间相互识别的物质基础是细胞膜分子，包括细胞表面的多种抗原、受体和其它分子。细胞膜分子通常也称为细胞表面标记（cell surface marker) 。细胞膜分子的种类相当繁多，主要有白细胞分化抗原、T细胞受体（TCR ）、B细胞识别抗原的膜免疫球蛋白、主要组织相容性复合体抗原、粘附分子、细胞因子受体、免疫球蛋白Fc 段受体及其它受体和分子等。白细胞分化抗原（CD ）白细胞分化抗原，又称为族分化抗原(cluster of differentiation, CD) 是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等）在分化成熟为不同谱系（lineage ）和分化不同阶段以及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。造血干细胞—B 祖细胞—B 前体细胞—早期B细胞—成熟B细胞造血干细胞—T 祖细胞—T 前体细胞—早期T细胞—成熟T细胞白细胞分化抗原（CD ）T细胞在胸腺内的发育过程：——————————————————————外层皮质内层皮质髓质CD4-/CD8- CD4+/CD8+ CD4+ 或CD8+ 10% 75% 15% ——————————————————————举例：CD45——所有WBC 表面标志CD3—T 细胞表面标志，CD19—B 细胞表面标志CD56—NK 细胞表面标志，CD11a—淋巴细胞表面标志流式细胞术以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(微粒)的性状进行定性或定量分析的技术 （二）细胞免疫功能检测1. 细胞免疫功能监测 破坏→→→→→HIV←←←←←破坏 ↓感染↑↑CD4+T 淋巴细胞→调控→细胞因子（辅助性T淋巴细胞） ↓指令HIV 特异性CTL←转化←CD8+T 淋巴细胞 （细胞毒T淋巴细胞—CTL ） CD4+T 淋巴细胞计数：其膜上存在HIV 包膜蛋白gp120 受体，故HIV 能特异性破坏CD4+T 淋巴细胞，导致其进行性减少，其后果是细胞免疫功能衰竭，同时可出现各种机会性感染和肿瘤。正常值：410~1590cell /mm3  临床意义：（1）了解HIV 感染者/AIDS 患者的细胞免疫功能。（2）选择抗病毒治疗时机（建议CD4+ 细胞为300cell/mm3 时开始抗病毒治疗。（3）监测抗病毒治疗效果。（4）判断疾病预后有特别重要的意义。 CD8+T 淋巴细胞计数：HIV 感染早期细胞数增加，晚期减少。正常值：190~1140cell /mm3  CD4+/ CD8+ 比值：降低。正常值：0.8~4.2 2 、免疫重建评价 李太生教授等认为AIDS 患者CD4+ T 淋巴细胞数量的重建可分为两个阶段：（1）快速增长期：抗病毒治疗的最初三个月，血浆HIV-RNA 水平快速下降，CD4+ 、CD8+T 淋巴细胞数量快速增长，进一步分析细胞表型提示，新增长的CD4+ T 淋巴细胞主要为CD4+CD45RO+ T 淋巴细胞（CD4 记忆细胞），而CD4+CD45RA+ T 淋巴细胞（CD4 纯真细胞）无明显变化。（2）缓慢增长期：抗病毒治疗三个月之后，CD4+T 淋巴细胞数量缓慢增长，进一步分析细胞表型提示，CD4+CD45RO+ 细胞（CD4 记忆细胞）增长变慢，而CD4+CD45RA+ （CD4 纯真细胞）开始启动增长。此阶段意味着真正的免疫重建。3 、免疫活化HIV 感染的持续存在导致了免疫系统各类不同的效应细胞的慢性活化。这种持续不断的免疫活化在某些情况下抑制了HIV 的繁殖，阻止了HIV 的扩散，产生有益作用。但在另外一些情况下，可引起免疫免疫系统的过度活化，破坏了正常的免疫调节，导致免疫衰竭。现在有不少学者认为HIV 感染最终导致AIDS 的根源所在应该归结于免疫活化。 T 淋巴细胞免疫活化表现为：CD4+ 、CD8+T 淋巴细胞表达的CD25 、CD26 、CD29 、CD69 、CD38 、HLADr 细胞增加。我们的研究结果表明：HIV 感染者/AIDS 患者免疫活化程度与血浆HIV-RNA 水平、患者病情程度呈很好的正相关关系，而与细胞免疫功能及免疫重建情况呈负相关关系；免疫活化标志的检测不仅能监测病情的程度，还有助于了解患者对治疗的反应。 免疫细胞表面的免疫活化标志： CD4+ 、CD8+T 淋巴细胞表达的CD25 、CD26 、CD29 、CD69 、CD38 、HLADr 细胞增加。 体液中的免疫活化标志血清中T细胞免疫活化标志主要有2- 优球蛋白（2- M ）、新蝶吟（neopterin ）、可溶性IL-2 受体（SIL-2R ）和可溶性CD8 表型标志（SCD8 ）。血情中B细胞免疫活化标志主要包括lgG 、lgM 、lgA 及循环免疫复合物（CICS ）等。4 、细胞因子及其生物活性