细胞凋亡 apoptosis 概述apoptosis 研究历史定义★与死亡的区别★功能apoptosis 早在1972 年Kerr 等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis ），另一种是创新提出的程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD ）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis ）。apoptosis 定义apoptosis 细胞坏死细胞凋亡与坏死的区别★———————————————————细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长维持内环境稳定发挥积极的防御功能所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。apoptosis 概述凋亡过程与调控发生机制凋亡与疾病apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis apoptosis 生化改变apoptosis 凋亡时细胞的形态学改变生化特征： ①胞浆内Ca2+ 浓度升高。②细胞内活性氧增多。③质膜通透性变大。④DNA 内切酶活性被激活升高，双链DNA 在核小体之间切断形成~185bp 为基数的有序片段。⑤Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain ）活性升高。细胞凋亡的生化改变细胞凋亡的生化改变特点：cysteine-containing aspartate-specific protease （含半胱氨酸的天门冬氨酸特异水解酶）apoptosis 细胞因子：IL-2 ，神经生长因子某些激素某些二价金属阳离子、药物apoptosis 凋亡信号的转导apoptosis 凋亡的调控凋亡相关因素凋亡信号的转导凋亡相关基因apoptosis 一、BcL-2 族分子BcL-2:bcL-2 基因是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一,其表达的蛋白质BcL-2 蛋白最初发现于B- 淋巴细胞瘤/白血病-2 （B cell lymphoma/Leukemia-2,BcL-2) 而得名，与线虫ced9 基因表达的Ced-9 分子在结构上有同源性，具有抗凋亡作用。BcL-2 的高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引发的细胞凋亡。如γ- 射线、糖皮质激素、热休克、多种化疗药物。BcL-2 的同源基因和蛋白其中一类呈抗凋亡作用，有BcL-2,BcL-w ，BcL-XL 、BFL-1 、Brag-1 、MCL-1 ，AI 。另一类呈现促凋亡作用的，有Bax ，Bak, Bok ，BcL-Xs ，Bad, Bid, Bik ，Hrk ，Bim 等。BcL-2 基因家族成员自身或彼此之间有形成二聚体或多聚体的能力，BcL-2 家族的蛋白与蛋白相互作用调节着细胞的存活与凋亡。apoptosis apoptosis 概述凋亡过程与调控发生机制凋亡与疾病apoptosis 概述凋亡过程与调控发生机制凋亡与疾病apoptosis 细胞凋亡与疾病的关系——该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病，细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元退行性疾病，病毒感染不足与过度并存：动脉粥样硬化㈢细胞凋亡不足与过度并存由于细胞类型的差异，各种细胞在致病因子作用下，有些可表现为凋亡不足，而另一些细胞可表现为凋亡过度，因此同一疾病或病理过程中两种情况也可同时存在。例如：动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS ）附：细胞凋亡检测 一、Annexin V-FITC 结合膜表PS 实验二、细胞培养液LDH 活性检测三、核DNA 片段检测1.DNA Ladder 2.Tunel 法四、镜检凋亡小体五、细胞凋亡反应核心因子检测六、流式细胞术BcL-2 抗凋亡机制：直接抗氧化抑制线粒体释放促凋亡蛋白质抑制凋亡调节蛋白的细胞毒作用抑制凋亡蛋白酶的激活维持细胞钙稳态P53 基因wtP53 ——修复受损的DNA ，如修复失败则诱导细胞凋亡突变的P53 失活的P53 丧失监视DNA 损伤的功能射线，毒素P53 蛋白+ 细胞凋亡分子警察促进凋亡基因双向调控基因凋亡的调控C-myc 是一种癌基因，是调控细胞周期的主要基因。编码的蛋白是DNA 结合蛋白，调控基因转录，在GF 充足时主要激活介导细胞增殖的基因；反之激活凋亡基因。C-myc Bcl-x 是1933 年发现的一类与Bcl-2 相关基因。Bcl-xl——抑制细胞凋亡。Bcl-xs——促进细胞凋亡。㈠氧化损伤1. 氧化应激（oxidative stress ）的概念------ 指机体活性氧产生过多或抗氧化能力下降，活性氧的清除不足，导致活性氧在体内积聚并引起氧化损伤的病理过程。氧化损伤的后果之一就是诱导凋亡。2. 氧化应激引起细胞凋亡的可能机制：①DNA 受损激活P53 基因膜通透性↑Ca 内流↑DNase ②生物膜损伤　ΔΨm↓脂质过氧化产物↑③多聚ADP 核糖合成酶活化，NAD ＋耗竭，ATP 大量消耗④可活化NF-kB 、AP-1 ，加速细胞凋亡相关的一些基因表达㈡钙稳态失衡Ca2 ＋作为许多细胞生命活动的第二信使，在细胞凋亡中的作用也倍受关注，凋亡发生时胞浆中Ca2 ＋↑，并激活凋亡过程中的关键酶类，其诱导细胞凋亡的机制为：①激活Ca2 ＋/Mg2 ＋依赖的DNase ②激活谷氨酰胺转移酶（GTase ），促进凋亡细胞中蛋白广泛交联，有利于凋亡小体的形成③激活Ca2 ＋敏感的蛋白酶核骨架蛋白酶核基质蛋白丝氨酸蛋白酶膜蛋白④激活核转录因子，加速促凋亡基因的转录㈢线粒体损伤目前证据显示，线粒体的功能改变在细胞凋亡的发生中起重要作用表现为线粒体内膜通透性↑线粒体内膜的跨膜电位Δψm↓能量合成水平↓线粒体功能和结构破坏引起细胞凋亡的可能机制：凋亡诱导因素作用于细胞后线粒体内膜跨膜电位（Δψm ）下降，线粒体内外膜之间的通透性转换孔PTP 开放；使细胞凋亡启动因子（Cyt.C ）,凋亡蛋白酶激活因子（Apaf ）和凋亡诱导因子（AIF ）释放apoptosis 发生机制Ⅰ凋亡诱导因素线粒体跨膜电位↓线粒体PTP 开放Cyt.C,Apaf, 等释放AIF 潜在Dnase 活化Dnase 激活Caspases 细胞凋亡线粒体损伤1. 线粒体内的凋亡因子在线粒体内外的腔隙中含有许多涉及细胞凋亡的因子，包括其中特有cyt.c 、AIF ，以及与胞浆共有的Pro- Caspase-2 、3、7、9，很多内外因素损伤线粒体膜的完整性，促使线粒体释放这些凋亡因子，即可诱导细胞凋亡。cyt.c AIF----(+)DNase Apaf Apaf-1 与Ced-4 同源Apaf-2 与cyt.c 同源Apaf-3 与Pro-Caspase-9 同源2. 线粒体膜通透性转变的影响因素BcL-2 基因家族阻止线粒体膜通透性改变PKC-δ[Ca2+]↑促进线粒体膜通透性改变线粒体老化3. 线粒体跨膜电位（Δψm ）下降与细胞凋亡以上介绍了细胞凋亡的发生机制——氧化损伤、钙稳态失衡、线粒体损伤。三者既可单独启动，又可联合作用，三种机制互相联系，互为因果，是很多凋亡诱导因素的共同通路，也就是所谓细胞凋亡的恶性网络假说（deleterious network hypothesis) Mitochondria in Apoptosis 	 凋亡与疾病㈠细胞凋亡不足⒈肿瘤：凋亡抑制基因Bcl-2 基因过高表达------ 凋亡衰减（前列腺癌）促凋亡基因如p53 基因突变或缺失，肿瘤发生率↑⒉自身免疫病———自身抗原受到自身抗体或致敏T淋巴细胞的攻击而损伤T 、B淋巴细胞通过正选择和负选择才能发育、分化成熟负选择：凋亡清除针对自身组织抗原和TCR 的双阳性细胞正选择：保留能够识别自身组织抗原的T细胞，并增殖成熟㈡细胞凋亡过度⒈心血管疾病⑴心力衰竭⑵心肌缺血与再灌注损伤———坏死与凋亡共存发生机制：氧化应激；细胞内钙超载；Fas 受体上调；p53 基因转录增强凋亡特点：①早期凋亡为主，晚期坏死为主②梗死灶中央以坏死为主，周边凋亡为主③慢性、轻度缺血以凋亡为主，急性、重度缺血则常常发生坏死④IR 引起的细胞凋亡有时比单纯缺血更严重⒉神经元退行性疾病———特定神经元进行性丧失为病理特征的疾病阿尔茨海默病（Alzheimer disease AD ）AD 主要是由于海马及基底神经核的胆碱能神经元大量丧失,病理切片上可见β- 淀粉样蛋白沉积和神经元缠结机制：β- 淀粉样蛋白基因位于21 号染色体，当钙超载、氧化应激或神经生长因子分泌不足时，Ca2 ＋内流增加，激活与β- 淀粉样蛋白合成有关的基因，使β- 淀粉样蛋白含量增加，沉积于神经元内，进一步激活周围的Mφ释放细胞因子和炎性介质促进凋亡的发生⒊病毒感染病毒感染宿主细胞后有两种结局：一是诱导细胞凋亡从而限制病毒生长（肝炎病毒）；二是由病毒基因表达的蛋白抑制宿主细胞凋亡，造成持续性感染或增加某些病毒的致癌可能性。AIDS: 由HIV 感染引起，其关键是CD4+ 淋巴细胞被破坏，导致CD4+ 淋巴细胞显著减少，相关免疫功能缺陷。CD4+ 淋巴细胞与HIV 感染者病情发生发展有密切关系，它决定感染者是否发病和发病的速度和严重程度。HIV 感染导致CD4+ 淋巴细胞发生凋亡的相关因素：1 ）HIV 的基因产物GP120 能直接启动CD4+ 淋巴细胞的死亡程序2 ）合胞体形成：3 ）Fas 基因表达上调4 ）T细胞激活激活诱导的细胞死亡5 ）细胞因子受感染的Mφ释放TNF 增多6 ）tat 蛋白：诱导CD4+ 淋巴细胞产生OFR ，增强Fas 表达7 ）慢性感染时，受感染CD4+ 淋巴细胞作为效应细胞，可增强未感染的CD4+ 淋巴细胞对凋亡的敏感性AS——血管内皮细胞凋亡过度而血管平滑肌细胞凋亡不足血脂↑（oxLDL ）血流动力学改变动脉内膜功能受损血管内皮解剖性损伤单核C粘附、移行内膜下内皮下胶原暴露吞噬LDL 成为泡沫C 血小板激活释放GF （PDGF 、FGF 、TGF-β、EGF ）刺激平滑肌C、成纤维C增生刺激结缔组织形成、抑制平滑肌C增生细胞凋亡在疾病防治中的意义细胞凋亡是一个程序化过程，可以通过不同的手段在不同的阶段进行干预而治疗疾病㈠合理利用凋亡相关因素1. 诱导靶细胞凋亡放疗、化疗高热、高温2. 减少细胞凋亡NGF 、促生长因子抗氧化剂抑制Bcl-2 抗凋亡作用促进促凋亡基因作用，如：ICE 引发氧化应激，增强P53 促凋亡作用㈡干预凋亡信号转导㈢调节凋亡相关基因㈣控制凋亡相关酶学机制㈤防止线粒体跨膜电位的下降* * apoptosis 凋亡过程与调控发生机制凋亡与疾病凋亡在疾病防治中的意义概述概述概述概述Apoptosis(apo- ptosis) PCD （programmed cell death ）★由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程概述特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放酶，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症反应一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。——————————————————————————————————————坏死凋亡apoptosis 概述1. 性质2. 诱导因素较弱刺激，非随机发生3.