中国药典2010 版微生物检验——现状与展望胡昌勤中国药品生物制品检定所2010 年5月26 日上海中国药典2010 版微生物检验——现状与展望1、中国药典2010 年版微生物检验框架及特点简要介绍中国药典2010 年版微生物检验的基本特点。2 、药品微生物检验的挑战和机遇结合近年与微生物污染紧密相关的几件药害事件，分析当前药品微生物检查面临的问题与对策。3 、微生物检验重点实验室建设规划与发展药品微生物检验重点实验室建设的现实意义，以及在未来药品微生物检验、控制和监管中可能发挥的作用。阐述以微生物实验室分析技术平台为基础、加强生产过程微生物监控和监管为重点、改变我国医药产品微生物高风险现状的基本思路。药品微生物检验概况药品质量标准【性状】【鉴别】【检查】无菌/微生物限度【含量测定】药品质量体系图1 药品质量体系构成与相互关系药品微生物检验概况医药产品是人类与疾病斗争的工具。在世界各国的医药实践中，由于药品中污染微生物而引发的悲剧时有发生。药品微生物检验概况药品中污染的微生物通过微生物体及其分泌代谢产物导致机体过敏、中毒、感染等，严重的可以直接导致菌血症危及生命。此外，某些药品中污染微生物通过代谢活动改变药物组成、破坏有效成份而造成疗效改变或丧失。药品微生物检验概况所以，世界各国高度重视药品微生物检查，无菌/微生物限度检查均为各国药典中的重要内容。药品微生物检验概况我国开展药品无菌检查和微生物限度检查已有数十年的历史。新中国第一部药典（1953 年版）收载了无菌检查法。我国开展药品微生物限度检查始于1972 年。1978 年颁发了第一个“药品卫生标准”。药品微生物检验概况在中央和各地政府有关部门的关怀和重视下，经过我国药品微生物检验工作者几十年来的艰苦奋斗，我国药品微生物检验工作不断发展，标准不断完善，逐步建立起了符合我国国情的药品微生物检验标准体系。至2010 版中国药典，我国药品无菌、微生物限度检查方法和标准在科学性、合理性以及与国际接轨方面均有了长足进展，使我国药品无菌和微生物限度检查步入了一个崭新的时期。2006 年7～8月发生了震惊全国的“欣弗事件”2006年11月1日晚，肇事企业安徽华源生物药业有限公司原总经理裘祖贻，在公司办公室自杀身亡。据推测，其自杀原因可能是承受不了“欣弗欣弗”事件的重压。药品微生物检验现状药品微生物检验的机遇与挑战从“欣弗”到“刺五加”，频繁的不良事件，把药品微生物检验工作推到一个前所未有的关注高度，提供了发展的机遇；药品质量事故高发期，如何快速、准确地获得检验结果，又是对当前药品微生物检验工作的一个挑战。中心任务把握机遇，——全面推进我国药品微生物检验工作；迎接挑战，——在突发、应急检验中及时提供一个可靠的检验结论。微生物检验与微生物控制的关系图2 药品微生物控制、微生物检验与参数放行中国药典2010 年版框架2010 年版《中国药典》已经编制完成，由中国医药科技出版社出版发行，2010 年7月1日正式实施。2010 年版《中国药典》是新中国成立60 年来组织编制的第九版药典，新版药典在总结历版药典的基础上，充分利用近年来国内外药品标准资源，注重创新与发展，实事求是地反映了我国医药产业和临床用药水平的发展现状，为进一步加强药品监督管理提供了强有力的技术支撑。2010 年版《中国药典》分为三部出版，一部为中药，二部为化学药，三部为生物制品。一、二、三部共同采用的附录分别在各部中予以收载，并尽可能做到统一协调、求同存异、体现特色。中国药典2010 年版框架2010 年版《中国药典》关于微生物检查有以下主要特点：规定眼用制剂按无菌制剂要求，明确用于烧伤或严重创伤的外用剂型均按无菌要求。中药橡胶膏剂首次提出不得检出致病菌检查要求。新增抑菌效力检查法指导原则、药品微生物检验替代方法验证指导原则、微生物限度检查法应用指导原则、药品微生物实验室规范指导原则等，以缩小附录在微生物方面与国外药典的差距。中国药典2010 年版框架USP31-Chart10 Microbiological Tests <51>Antimicrobial Effectiveness Testing <55>Biological Indicators-Resistance Performance Tests <61>Microbial Limit Tests(<62>) <71>Sterility Tests <1111>Microbiological Attributes of Nonsterile Pharmaceutical Product <1112>Application of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceutical Product <1116>Microbiological Evalution of Clean Rooms and Other Controlled Environments <1117>Microbiological Best Laboratory Practices <1223>Validation of Alternative Microbiological Methods 中国药典2010 版微生物检验标准的变化质量标准体系基本基本与国外接轨强调微生物检验的验证及过程控制对滴眼剂的质控水平大幅度提高部分品种特别是抗生素品种的无菌检查法由附录走入各论无菌检查法微生物限度检查法灭菌法抑菌效力检查法指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则微生物限度检查法应用指导原则药品微生物实验室规范指导原则如何建立我国的微生物检验质控体系！药品质量标准药品标准中的质控项目、分析方法和质控限度构成了药品标准的主体。质控项目、质控限度的合理性及检验方法的可操作性直接影响着质量标准的可执行性。质量标准的现状质控项目：目前抗生素药品标准的质控项目与国外标准相比已经趋于一致。质控方法：通过与国外方法的比较确定国内的质控方法。质控限度：基本参照国外药典。建立适合于中国国情的微生物质控体系药品标准实验室建设2010 版微生物检验方法增修订要点无菌检查法中国药典与USP 、BP 方法的比较微生物限度检查法中国药典与英美药典比较与国外药典的差异硫乙醇酸盐流体培养基大豆－胰酪胨培养基(TSB) 与改良马丁培养基比较微生物限度检查法培养基的比较培养基体系的差异使得中国药典结果与国外药典结果之间不具有可比性。中国药典培养基体系的灵敏度较国外药典低。药品微生物检验实验室需要解决哪些问题？是否有污染何种菌污染从那儿被污染结果判断-欣弗事件结果判断-刺五加事件第一阶段：保证检验结果的准确可靠加强微生物实验室建设，建立FTIR 细菌谱库，增加检验结果的可信度；建立应急检验SOP ，提升实验室的快速检验能力；开展细菌的鉴别研究，实现对污染菌的鉴别。第二阶段：实现对污染菌的溯源追踪开展分子生物学方面的工作：细菌基因物理图谱的分析（脉冲场电泳分析技术）16S RNA 鉴别分析（RCP 分析技术）形成能独立应对突发应急事件的能力微生物IR 图谱测定基本步骤FT-IR 分析中检所判断药品污染的方案药品微生物实验室的现状嗜麦芽寡养单胞菌（S.maltophilia ）304G （Al.faecalis ）309L （Al.faecalis ）308L 肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）307G 肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）306L/6G 1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2 、粘质沙雷菌（S.marcescens ）305L ；305G 1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2 、阴沟肠杆菌（Enter. cloacae ）303L ；303G 1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2 、粘质沙雷菌（S.marcescens ）298L ；298G 1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2 、粘质沙雷菌（S.marcescens ）0206G 1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2 、粘质沙雷菌（S.marcescens ）0206L 鉴定结果编号欣弗培养物洁净环境常见菌：头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis ）溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus ）缓症链球菌（Streptococcus mitis ）科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii ）藤黄微球菌（Micrococcus luteus ）山羊葡萄球菌（Staphylococcus caprae ）肺炎克雷伯巨大芽孢杆菌粘质沙雷菌× 夺命的欣弗Enterobacter cloacae 9196-d Enterobacter cloacae 1016-TSA-EDM-2 Enterobacter cloacae 1016-TSA-EDM-1 Enterobacter cloacae 1016-TSA-9196-D-L-2 Enterobacter cloacae 1016-TSA-9196-D-L-1 Enterobacter cloacae 1016-9196-4 Enterobacter cloacae 1016-9196-3 Enterobacter cloacae 1016-9196-2 Enterobacter cloacae 1016-9196-1 Enterobacter cloacae 1016-9196-D-L-4 Enterobacter cloacae 1016-9196-D-L-3 Enterobacter cloacae 1016-9196-D-L-1 BD 鉴定菌株云南样品培养物革兰氏染色培养物革兰氏染色直接涂片革兰氏染色问题刺五加Enterobacter cloacae H6-TSA-3-2 Enterobacter cloacae H3-TSA-4-2 Enterobacter cloacae H3-SSI-2 Enterobacter cloacae H6-TSA-3-1 Enterobacter cloacae H3-TSA-4-1 Enterobacter cloacae H3-SSI-1 BD 鉴定菌株完达山样品× 脉冲场电泳分析药品微生物检验重点实验室建设2009 年4月23 日中检所会同北京、天津、上海、黑龙江、江苏、浙江、广州、四川、总后等九家药检所的主管业务所长及微生物检验部门负责人在浙江省杭州市首次对药品检验所微生物检验重点实验室的建设问题开展研讨。增强系统能力应对应急检验固体培养基划线培养取样并在水中制成均匀混悬液点样真空减压干燥制成菌膜液体培养基培养离心、盐水洗、水洗扫描图谱培养制样标示谱段(cm-1) 振动类型代表的细胞组分Ｗ１3000-2800 CH 伸缩振动区细胞膜脂肪酸Ｗ２1800-1500 酰氨（Ⅰ、Ⅱ）区细胞蛋白和肽类，DNA 、RNA 结构Ｗ３1500-1200 混合区蛋白质和脂肪酸，磷酯Ｗ３１1500-1400 二级脂肪酸区两性细胞质膜成分（蛋白质和类脂）Ｗ４1200-900 C-O 伸缩振动区细胞壁多聚糖Ｗ５900-700 指纹区长链脂肪酸不同来源的阴沟肠杆菌的FT-IR 一阶导数光谱（1180-900cm-1 ）的比较蓝色——来自实验室无菌阳性样品中的分离菌绿色——其它来源的无菌阳性样品中的分离菌定期采集环境菌FTIR 图谱测定外环境菌谱库内环境菌谱库药品微生物检测FTIR 图谱测定相似不相似药品污染实验环境污染相似不相似操作失误进一步比较重试* 可控性安全性有效性图2 夺命的欣弗图1 死于欣弗的儿童技术落后、标准化程度低；重要性被忽视、事故频繁！——标准进步与标准化滞后的矛盾建立合理的药品微生物风险评价体系——企业：PAT (Processing Analytical Technology) 建立合理的上市药品监督抽验机制——监督管理部门：以不良反应为先导的国家抽验计划建立完善的药品微生物检验和控制体系——检验和质控部门：树立微生物检验新理念，检测实验微生物控制体系的认证与监管——生产部