第十一章抗生素类药物的分析供试品溶液：0.2 mg/ml( 流动相溶）对照溶液:供试品溶液，加流动相稀释成6 g/ml 对照溶液进样20 l ，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10% 取供试品溶液和对照品溶液各20 l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2.5倍供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰的面积Your company slogan 中国药科大学药学院药分教研室中国药科大学药学院药分教研室在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称β–内酰胺类氨基糖苷类四环素类大环内酯类多烯大环类多肽类1. 抗生素（antibiotics）2. 分类中国药科大学药学院药分教研室一、概述化学纯度较低活性组分易发生变异稳定性差3. 来源4. 抗生素的特点化学合成半合成生物合成（发酵）生产工艺复杂发酵过程不易控制，易受污染原因中国药科大学药学院药分教研室一、概述采用生物学法与物理化学法鉴别：理化方法、微生物法检查：水分、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等含量/效价测定：微生物法：与临床疗效吻合，灵敏度高，但操作复杂费时；理化方法：准确度与专属性较高，且操作简便，但与临床疗效有偏差5. 抗生素质量分析一、概述中国药科大学药学院药分教研室1. 化学结构包括青霉素类和头孢菌素类青霉素类：6- APA 为母核头孢菌素类：7- ACA 为母核中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类酸性较强（pKa 2.5-2.8）临床常用其碱金属盐（水溶性好）酸性(羧基)  有多个手性碳旋光性青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构UV（共轭）干燥条件较稳定，溶液不稳定稳定性(内酰胺)  2、主要理化性质降解失效氧化剂、酸、碱酶、金属离子、Δ青霉素中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类2、主要理化性质中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类1）羟肟酸铁反应：β–内酰胺类羟肟酸显色2）茚三酮反应α- 氨基蓝紫色3）双缩脲反应β–内酰胺类紫色4）光谱法（UV、NMR）5）色谱法（HPLC、TLC）NH2OH · HCl NaOH Fe3+ H+ 茚三酮Δ碱性酒石酸铜呈色反应3、鉴别中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类3、鉴别-------------头孢利定的NMR 鉴别法( JP14) NMR 鉴别法单峰信号取本品50 mg 溶于0.5 ml 重水中，测定NMR 光谱时，应显示多重峰信号多重峰信号δ= 3.8 附近δ= 6.9～7.5 δ= 7.9～9.0 2 3 5 强度比中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类3、鉴别-------------头孢氨苄鉴别的TLC 条件CHP（2000）5 mg/ml 2μl  硅胶G 0.1mol/L 枸橼酸液-0.2 mol/LNa2HPO4- 丙酮(120:80:3) 0.1% 茚三酮溶液显色USP（24）25 mg/ml 5μl 硅胶醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc (48:18:14:14) 短波长UV 光检出BP（1999）0.4%( W/V) 1μl  硅烷化硅胶HF254 15.4% NH4Ac(pH6.2)- 丙酮(85:15) 254 nm 检出中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类4、特殊杂质检查--------------聚合物、有关物质、异构体等色谱条件与系统适用性试验测定法头孢他啶中聚合物测定头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查色谱条件与系统适用性试验异构体和有关物质举例：中国药科大学药学院药分教研室二、β–内酰胺类头孢他啶中聚合物测定-----------色谱条件与系统适用性试验葡聚糖凝胶G-10 理论板数应不低于900，拖尾因子在0.75～1.5 254 nm  检测流动相A：含3.5%硫酸铵的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液蓝色葡聚糖2000 中国药科大学药学院药分教研室头孢他啶中聚合物测定-----------色谱条件与系统适用性试验葡聚糖凝胶G-10 峰面积的RSD 应小于5.0% 254 nm  检测流动相B：0.01% 十二烷基硫酸钠溶液头孢他啶对照品溶液中国药科大学药学院药分教研室头孢他啶中聚合物测定-----------测定法葡聚糖凝胶G-10 254 nm  检测流动相A：含3.5%硫酸铵的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液头孢他啶样品（20 mg/ml）外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3% AS 中国药科大学药学院药分教研室头孢他啶中聚合物测定-----------测定法葡聚糖凝胶G-10 254 nm  检测流动相B：0.01% 十二烷基硫酸钠溶液头孢他啶对照品溶液AR 外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3% 中国药科大学药学院药分教研室头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查头孢呋辛酯A，B 异构体之间、头孢呋辛酯A 异构体与头孢呋辛酯△2-异构体之间的分离度应大于1.5；色谱条件：ODS 分析柱；0.2 mol/L 磷酸二氢铵-甲醇（62:38）为流动相；流速1 ml/min；检测波长278 nm。系统适用性试验：理论板数按头孢呋辛酯A 异构体峰计算，应不低于1500。中国药科大学药学院药分教研室40 0 20 60 0 30 20 10 时间( min) 峰高( mAU) 6 5 4 A 异构体B 异构体1 13.954 11.919 2.401 B 异构体峰的相对保留时间约为0.85，A 异构体峰的相对保留时间为1.0。供试品色谱图中, A 异构体峰的面积与A、B 异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查中国药科大学药学院药分教研室异构体中国药科大学药学院药分教研室头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查有关物质5、含量测定-----------碘量法（ChP2000）二、β–内酰胺类中国药科大学药学院药分教研室原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反应，但其碱性降解产物可消耗碘青霉素族头孢菌素族NaOH 水解4 I2H + 8 I- I2+2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 定量过量剩余5、含量测定-----------碘量法（ChP2000）中国药科大学药学院药分教研室反应分两步进行：水解反应(按化学计算量进行) 氧化-还原反应(无定量关系，受温度、pH 值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定) 5、含量测定-----------碘量法（ChP2000）中国药科大学药学院药分教研室因样品中杂质会消耗碘，故应作空白试验。加入样品，不加碱；其余试剂（醋酸盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠）都要加碱。空白试验: 空白试验与经典空白试验不同：5、含量测定-----------碘量法（ChP2000）中国药科大学药学院药分教研室试验条件:（I2 氧化）弱酸性（pH4.5）20分钟后，耗碘量随时间的变化较小碱↑I2 →IO3- + I- 酸↑某些药物与碘生成复盐沉淀温度（24～26℃）温度＞38 ℃时未水解的供试品亦消耗碘反应时间：（20分钟）5、含量测定-----------碘量法（ChP2000）中国药科大学药学院药分教研室含量％＝×  × 对照品％V 样空- V 样W 对V 对空- V 对W 样灵敏度高：样品: 碘= 1 : 8 反应条件、实验操作要求高1份含量V 对、V 对空V 样、V 样空加试剂次序、反应时间、滴定速度相同特点：5、含量测定-----------电位配位滴定法（汞量法）中国药科大学药学院药分教研室原理：青霉素不与汞盐反应，其碱性降解产物可与Hg2+ 络和。Hg+ + 2R-SH  (RS)2Hg + 2H+ 方法说明：a、空白试验与碘量法类似，加样品，不加NaOH  b、与碘量法相比，汞量法不需对照试验5、含量测定-----------其他常用方法中国药科大学药学院药分教研室酸碱滴定法：应用广泛硫醇汞盐法羟肟酸比色法HPLC 法：应用广泛咪唑HgCl2 （λmax 324～345nm）青霉素青霉烯酸硫醇汞盐NH2OH H+ Fe3+ β–内酰胺类红色5、含量测定（例）-----------阿莫西林克拉维酸钾片中国药科大学药学院药分教研室填充剂流动相检测波长峰形阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5 色谱条件与系统适用性试验十八烷基硅烷键合硅胶磷酸盐缓冲液-甲醇(95:5) 流速为0.7 ml/min；检测波长为220 nm 5、含量测定（例）-----------阿莫西林克拉维酸钾片中国药科大学药学院药分教研室取本品10片，置1000 ml 量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10 ml，置50 ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10 l 注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1 ml 中含阿莫西林0.5 mg 和克拉维酸0.25 mg 的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S 和C8H9NO5 的含量。测定法：中国药科大学药学院药分教研室1. 化学结构三、氨基糖苷类都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷；分子结构中都含有多羟基；均为碱性抗生素；链霉素中国药科大学药学院药分教研室临床应用其硫酸盐碱性(氨基)  （糖）：有多个手性碳旋光性(糖) 水溶性溶解度(氨基、羟基) 强酸、碱条件均可水解稳定性(苷)  2、主要理化性质三、氨基糖苷类中国药科大学药学院药分教研室3、鉴别三、氨基糖苷类茚三酮反应：具羟基胺类，α- 氨基酸性质链霉素+ 水和茚三酮蓝紫色链霉素N- 甲基葡萄糖胺N- 甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反应：红色水解对二甲氨基苯甲醛乙酰丙酮OH- Your company slogan