生物技术医药生物技术农业生物技术工业生物技术环境生物技术材料生物技术.  .  . 工业生物技术含意：在工业规模的生产过程中使用或部分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务生物催化（Biocatalysis) 利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化的过程以生物催化法合成的主要产品生物催化发展的主要推动力新产品需求( 社会压力) - 健康：医药、检测- 日用品：洗涤用品、乳品、生物可降解塑料环境( 法律法规压力) －绿色化学、能源、温室效应得益/成本降低( 商业压力) - 生物分离新发现或基础研究( 技术压力）－基因工程/ 定点突变/定向进化、代谢工程、组合化学目前生物催化技术已成为各公司争夺的目标并且已成为一些公司谋求发展和提升地位的工具。Degussa 、DSM 、BASF 、Dow 、Lonza 等许多跨国公司都在积极采取措施，扩大他们在生物催化领域里的生产能力。在中国，国家重点基础研究计划（973 计划）将生物催化项目立项；国家高科技研究计划（863 计划）中增列工业生物技术专题。目前我国的谷氨酸和柠檬酸产量为世界第一。酶工程第一节绪论第二节酶的发酵生产第三节酶的分离纯化第四节酶的应用第一节绪论现代酶学研究主要沿着两个方向发展（1）酶的分子生物学方向：其主要任务是要从分子水平上更深入揭示酶结构与功能的关系；酶催化机制和调节机制；酶与生命活动的关系等理论问题，进一步设计酶、改造酶、在基因水平上进行酶的调节控制。（2）酶工程方向：其主要任务是研究如何经济有效地进行酶的生产、制备、应用，将基因工程、以及分子生物学的最新研究成果用于酶的生产，进一步开发固定化酶技术与酶反应器等。一、酶工程的概念酶工程就是利用酶催化作用，通过适当的反应器，工业化地生产人类所需要的产品或是达到某一特殊的目的。它是以现代酶学、现代生物学（包括生物化学、微生物学、遗传学及分子生物学等）的理论知识为基础，结合化学工程、生物技术、电子计算机等形成的一项高新技术。它包括酶的生产、制备与应用三个部分二、酶工程的种类根据研究和解决问题的手段不同，分为两类：1. 化学酶工程又为初级酶工程，是酶学理论与化学工程技术相结合的产物。化学酶工程研究的主要内容：（1）酶的制备工艺（2）酶和细胞的固定化技术（3）酶分子化学修饰（4）人工酶的合成（5）酶反应器、酶传感器（6）酶的应用等。含义：利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得所需要的酶的方法。如：用桔青霉发酵生产磷酸二酯酶；黑曲霉发酵生产淀粉酶；链霉菌发酵生产葡萄糖异构酶等。特点：微生物种类多，酶品种齐全繁殖快，生长周期短培养简便，提高酶产量。易于基因突变自20 世纪中叶以来，工业用酶制剂的市场得到了蓬勃发展。据统计数据表明：1981 年工业酶制剂生产量约65 000t ，产值4亿美元1985 年工业酶制剂约生产75 000 t ，产值约6亿美元进入20 世纪90 年代后，市场对酶制剂的需求增强，以世界上最大的酶制剂生产商丹麦的Novo Nordisk 公司为例：1993 年酶制剂销售为9亿美元；1998 年工业用酶的销售额为15.18 亿美元。国内外酶制剂生产应用差异1．规模：国外多公司重组国内重复建设、效益低投入：国外：开发经费高达15% ，甚至19% 销售额国内：研究、开发投入不足，占1% 销售额3 开发重点国外：大力研制、开发新酶种和新用途国内：品种少、剂型少第二节酶的发酵生产酶与细胞固定化酶和细胞固定化示意图实例从猪肉中纯化腺苷酸激酶。其催化反应为：纯化步骤：见下图借助各种物理或化学方法，将酶或细胞固定于水不溶性载体上的过程，称为酶与细胞固定化。水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术吸附法天然酶和固定化酶在应用中的一些比较1、酶稳定性差，易变性失活1 、稳定性高2 、酶和底物只能反应一次，难于回收利用，不仅成本高，而且难于连续化生产。2 、多次使用，易于回收，节约成本。装塔连续，用于自动化生产3 、反应液中混入酶蛋白，使产品的分离纯化复杂化3 、纯化简单，提高产物的质量葡萄糖氧化酶电极：固定化酶在传感器方面的应用：酶传感器：固定化酶与能量转换器(电极、场效应管、离子选择场效应管等)密切结合而成的传感装置，是生物传感器的一种。已广泛应用于临床诊断、工业发酵过程控制和环境监测等领域。其中研究最多、应用最广的是酶电极。第三节酶的分离纯化一、酶制剂的制备二、酶的纯化与精制三、酶的纯度与酶活力四、酶的保存提取和分离纯化酶时一般应注意的条件温度pH 值搅拌微生物污染　酶活性测定要进行比活力，总活力测定与比较比活力= 酶活力（单位）/mg 蛋白HPLC  一、酶制剂的制备（机械、物理、化学、酶学破碎法）（盐溶液、酸溶液、碱溶液、有机溶剂提取）高速冷冻离心机破碎细胞溶剂抽提离心分离浓缩干燥常速、高速、超速：转速8000r-25000r-80000r/min 二、酶的纯化与精制在酶的提取液中，不可避免地杂有其它小分子和大分子物质，其中，小分子杂质在相继的纯化步骤中一般会自然地除去；而大分子杂质包括有：核酸、粘多糖、其它蛋白质。核酸可加硫酸链霉素，聚乙烯亚胺，鱼精蛋白或MnCl2 等，使之沉淀移去，也可使用核酸酶降解。粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理。而纯化的主要工作，也是较困难的工作，就是要将酶从杂蛋白中分离出来酶纯化中常用方法超速冷冻离心机1、根据酶分子大小和形状的分离方法离心分离凝胶过滤透析与超滤2、根据酶分子电荷性质的分离方法离子交换层析层析聚焦电泳电泳仪3、根据酶分子专一性结合的分离方法亲和层析利用酶分子具有的专一而又可逆的亲和力，是生物分子分离纯化的技术；它具有结合效率高、分离速度快的特点。层析分离三、酶的纯度与酶活力酶的活力：酶活力高低是以酶活力的单位数表示1kat ＝特定条件下，每秒钟使1mol 底物转化为产物所需要的酶量酶的比活力：比较酶的纯度和活力的高低比活力= 酶活力（单位）/mg 蛋白质或RNA  酶的纯度：酶的比活力代表酶的纯度，但不说明实际纯净程度是多少总活力的＝回收率（产率) 某步骤后的总活力第一次总活力纯化倍数＝某步骤后的比活力第一次比活力（反映提纯过程中酶活力损失情况）（反映了纯化方法的效率）每一步骤前后都要进行酶活力测定，并做出总活力、比活力比较酶制剂的保存温度: pH 和缓冲液: 氧化/还原：蛋白质的浓度及纯度：超低温冰箱四、酶的保存* * Enzyme Engineering 酶工程用生物或生物分子机器生产产品和解决问题生物技术的具体应用生物催化生物技术产业化的三个浪潮医药生物技术（red biotechnology ）: 1982 年重组人胰岛素上市，上市基因工程药品5.4 亿-982 亿美元/1987-2011  农业生物技术(green biotechnology): 1996 年转基因大豆、玉米、油菜相继上市工业生物技术(white biotechnology):  世纪之交聚乳酸、聚交酯、生物钢相继上市(生物质材料) 工业生物技术是工业可持续发展最有希望的技术工业生物技术--- 迈向发达国家之战略生物催化化学工业发酵工业轻工业采矿医药食品能源材料生物安全环境生物催化是工业生物技术的核心技术生物催化技术具有的特点过程高效（物耗低，原子经济性高）反应温和（能耗低）环境友好（污染小）是绿色化学与绿色化工发展的重要趋势之一0.9 万吨/年抗菌素中间体6－APA 氨苄青霉烷酸1000 万吨/年生物柴油与汽油2万吨/年阿斯巴甜1.3 万吨/年聚乳酸10 万吨/年丙烯酰胺产量产品名称生物技术在全球精细化学工业的份额：15 ％-60 ％/2008-2010 年将传统的生产模式彻底加以变革，构建新一代的工业生物技术2020 年，50 ％的有机化学品和材料来自生物质材料生物催化酶工程概述国内外酶制剂工业概况酶的生产方法酶工程概述酶学研究简史1878 德国的Kuhne 定义Enzyme 原意为在酵母中1926 美国的Sumner 从刀豆中得到脲酶结晶（1947 年诺贝尔奖）1970 美国的Smith 发现限制性内切酶（1979 年诺贝尔奖）1969  日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。——酶工程诞生1986 美国核酶发现获得诺贝尔奖现代酶学研究发展的方向2. 生物酶工程是在化学酶工程基础上发展起来的，以酶学理论和以DNA 重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，又称为高级酶工程（advanced enzyme engineering ）。生物酶工程研究的主要内容：（1）克隆酶的生产（酶基因的克隆表达）（2）突变酶的生产（酶的遗传修饰）（3）新酶的生产（酶的遗传设计）酶的生产是指经过预先设计，通过人工操作控制而获得所需的酶的过程。酶的生产方法可分为提取法、发酵法和化学合成法。酶的生产方法含义：采用各种提取、分离技术从动物、植物或微生物细胞或组织中将酶提取分离出来。如：从动物胰脏中提取胰蛋白酶；从动物胃中提取胃蛋白酶；从木瓜中提取木瓜蛋白酶等特点：该法直接、简便易行，尤其适合动、植物资源丰富的地区。但动植物生长周期长，易受气候、地理环境的影响，不适于大规模工业化生产。且产品杂质较多，分离纯化困难。一、提取法二、发酵法含义：根据酶的一级结构，以氨基酸单体为底物，用化学的手段合成一个酶。如：1969 年，美国首次用化学合成法得到核糖核酸酶特点：合成成本高，难度大。三、化学合成法酶的生产方法国内外酶制剂工业概况目前在世界上最有影响的酶制剂厂主要有：丹麦的Novo Nordisk 公司美国的Genencor 国际公司英荷合资的皇家ＤＳＭ－Gist 公司( 三大公司销售额分别占世界酶制剂市场份额的４４％、29 ％、14-19 ％)  三大公司销售额占世界总额的～90% 国际市场酶制剂销售额比例Eg ：α- 抗胰蛋白酶1965 年：无锡酶制剂厂淀粉酶1979 年：糖化酶1990 年：碱性蛋白酶（加酶洗衣粉）1992 年：中性蛋白酶1995 年：无锡酶制剂厂引进耐高温淀粉酶和高转化率液体糖化酶，新双酶法1998 ：国外大公司纷纷入驻：2006 年：全新发展阶段，专用酶制剂和特种复合酶制剂，拓展新的应用领域。高档次、高活性、高质量、高水平我国酶制剂工业发展阶段国内酶制剂销售额比例国内外酶制剂工业概况酶的发酵生产概念和方式酶发酵生产的一般工艺流程酶发酵生产的概念经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物细胞，植物细胞和动物细胞）的生命活动，生产人们所需要的酶的过程。酶的发酵生产概念和方式酶发酵生产的方式: 液体深层发酵为主要方式酶发酵生产的一般工艺流程* * * * 意为“分离”Sheet3
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图表1
洗涤剂用酶纺织用酶乳制品用酶酿酒用酶饲料用酶焙烤食品用酶其它行业用酶0.00
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国际市场酶制剂销售额比例洗涤剂用酶纺织用酶乳制品用酶酿酒用酶饲料用酶焙烤食品用酶其它行业用酶0.00
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洗涤剂用酶纺织用酶乳制品用酶酿酒用酶饲料用酶焙烤食品用酶其它行业用酶0.00
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国际市场酶制剂销售额比例洗涤剂用酶纺织用酶乳制品用酶酿酒用酶饲料用酶焙烤食品用酶其它行业用酶0.00