主要内容概述免疫系统对外源化学物的毒性反应与机制免疫毒性检测方案免疫毒性试验方法与评价体液免疫和细胞免疫的关系体液免疫与细胞免疫之间，既各自有其独特的作用，又可以相互配合共同发挥免疫效应。进入体内尚未进入细胞的抗原（如细菌的外毒素、少量的细菌或病毒等）主要由体液中的抗体发挥体液免疫作用；而这些抗原一旦进入细胞内部，就要靠细胞免疫来将它们消灭、清除了。免疫毒理学概念：免疫毒理学（immunotoxico1ogy ）是毒理学与免疫学间的边缘学科，也是毒理学的一个新分支。它主要研究外源化学物和物理因素对机体免疫系统的有害作用及其机制。免疫毒理学是在免疫学和毒理学的基础上发展起来的，是一门十分年轻的学科。外来化合物对免疫系统作用的特点：反应的灵敏性反应的复杂性反应的选择性免疫毒理学的开篇之作Immune suppression as related to toxicology. Joseph G. Vos. CRC Crit Rev Toxicol. 1977 May; 5(1):67-101. Gordon G, Gibson R. Immunotoxicology. England: Academic Press, 1983 免疫毒理学的里程碑The international seminar on Immunotoxicology: the Immune System as a Target for Toxic Damage, in Luxembourg in 1984. (CEC-IPCS) Mechanisms of Suppression:Disruption of innate immunity 二恶英的免疫毒性靶器官：免疫系统（胸腺）低剂量二恶英即可攻击免疫系统。猴子暴露二恶英的浓度仅为10ng/Kg 时，白细胞数量就会降低；啮齿类动物，围产期暴露于TCDD 会影响胸腺的发育，导致细胞免疫的持续性抑制。而且在围产期暴露比成人暴露引起的T细胞功能减弱更大、更持久。二恶英的作用机制直接作用：对体液免疫和细胞免疫均有抑制作用，能减少B细胞的数量；间接作用：通过影响内分泌系统发挥作用（TCDD 和相关化合物能干扰内分泌系统，改变糖皮质激素、性类固醇激素、甲状腺激素、生长激素等的活性）。金属的免疫抑制作用铅、汞、镍和镉等金属与CD4+ 细胞的激活或引起抗体反应和细胞免疫抑制有关：铅：降低对感染性疾病的抵抗力砷化物：患病毒性带状疱疹的发病率较高缺锌影响机体免疫功能影响淋巴细胞增殖分化影响免疫记忆影响免疫细胞分泌细胞因子影响吞噬细胞和NK 活性铅对免疫功能的影响铅具有免疫毒性，在较低剂量可引起免疫功能改变，增加机体对内毒素和病原体的易感性体液免疫：抗体减少、B细胞表面受体减少、免疫记忆丧失细胞免疫：增殖分化障碍非特异性免疫：巨噬细胞数量减少，功能降低汞对免疫功能的影响中枢神经系统的不可逆损伤大剂量导致免疫功能下降和免疫抑制小剂量引起自身免疫性疾病与遗传因素和个体敏感性关系密切与TH1/TH2 失衡有关以肾炎为主抑制巨噬细胞分泌TNF 、NO 引起细胞凋亡外源化学物免疫抑制的机制：外源化学物引起免疫抑制的机制并未完全明了，而且不同的外源化学物可通过不同的机制影响免疫功能，总的来说可以分为直接作用和间接作用两大类。直接作用细胞毒作用外源化学物直接作用于免疫细胞和免疫器官，引起细胞死亡，免疫细胞数目减少，免疫器官萎缩，免疫功能抑制。对淋巴细胞成熟过程的影响外源化学物骨髓干细胞对淋巴细胞增殖、分化的影响间接作用内分泌素TCDD 和乙醇都可引起糖皮质激素升高环境因素营养障碍超敏反应是指机体受同一抗原再次刺激后产生的一种异常或病理性免疫反应。超敏反应与免疫反应本质上都是机体对某些抗原物质的特异性免疫应答，但超敏反应主要表现为组织损伤和/或生理功能紊乱，免疫反应则主要表现为生理性防御效应。分类根据发生机制和临床特点，可分为：Ⅰ型超敏反应—速发型或过敏反应型Ⅱ型超敏反应—细胞毒型或细胞溶解型Ⅲ型超敏反应—免疫复合物型或血管炎型Ⅳ型超敏反应—迟发型或细胞介导型Skin Prick Test Immediate and Delayed Phases of Type I Hypersensitivity II 型超敏反应（细胞毒性）是由IgG 或IgM 类抗体与靶细胞表面相应抗原结合后，在补体、吞噬细胞和NK 细胞参与作用下，引起的以细胞溶解或组织损伤为主的病理性免疫反应。III 型超敏反应（免疫复合物型）是由中等大小可溶性免疫复合物沉积于局部或全身毛细血管基底膜后，通过激活补体和血小板、嗜碱性、嗜中性粒细胞参与作用下，引起的以充血水肿、局部坏死和中性粒细胞浸润为主要特征的炎症反应和组织损伤IV 型超敏反应（迟发型）即迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity ，DTH ）Ⅳ型超敏反应是由效应T细胞与相应抗原作用后，引起的以单个核细胞浸润和组织细胞损伤为主要特征的炎症反应。Patch test 接触性皮炎Systemic lupus erythematosus 全身性红斑狼疮日本推荐的免疫毒性检测方案大鼠免疫毒性检测方案(NIPHEP) 美国国家研究委员会推荐的人群免疫方案美国食品与药品管理局（FDA ）及其药品评价和研究中心（CDER ）于2002 年10 月正式公布了新药研究中的免疫毒理学评价规范。提出要考虑药物对免疫系统五个方面的影响，除了免疫抑制、超敏反应和自身免疫外，还有免疫原性（immunogenecity ）和不良免疫刺激（adverse immunostimulation ）一、免疫抑制：二、免疫原性：三、超敏反应（药物过敏）：（一）Ⅰ型超敏反应：（二）Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应：（三）Ⅳ型超敏反应：（四）假过敏或类过敏反应：四、自身免疫：五、不良免疫刺激：免疫毒性试验方法免疫毒性试验方法与评价免疫学方法：（一）常规毒理学检查：（二）免疫功能评价：1 、NK 细胞活性测定：2 、巨噬细胞功能试验3 、体液免疫功能评价：4 、细胞免疫功能评价：5 、宿主抵抗力试验：常规毒理学检查血液学检测临床生化检测病理学组织检查免疫细胞功能的测定T 细胞功能测定：(1) 细胞增殖(转化)试验(2) 混合淋巴细胞反应(MLR) (3) T 细胞介导的细胞毒试验：CTL (4) 分泌功能检测(5) T 细胞功能的体内检测法2. B 细胞功能判定(1) B 细胞增殖(转化)试验：(2) 溶血空斑形成试验（PFC ）(3) 反向溶血空斑试验(RHPA) (4) 酶联免疫斑点法( ELISPOT) 体液免疫功能评价EPA Health Effects Test Guidelines: OPPTS 870.7800 Immunotoxicity (TSCA, FIFRA) 3. NK 细胞活性测定(1) 形态学检查法(2) 放射性核素释放法：用放射性核素(51 Cr、125I －UdR ) 标记靶细胞。( 3) 酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶( LDH) 活性。( 4) NAG 酶荧光比色法(4) 化学发光法(5) 流式细胞术：应用FCM 检测NK 细胞活性是根据PI 染料排斥法。PI 渗入死亡细胞内与DNA 和RNA 结合，在488 nm 波长激发下产生绿色荧光。此法既可以测定单个细胞毒活性，也可以用于总细胞毒活性试验。*还可利用荧光染料法，细胞光扫描法，双标记细胞毒法测定细胞毒性细胞的杀伤效应。4．吞噬细胞功能测定(1) 中性粒细胞趋化功能测定：一般采用滤膜渗透法(Boyden 小室法)或琼脂糖平板法。(2) 中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定a. 显微镜检法b. NBT 试验：此项试验是测定中性粒细胞吞噬、杀菌功能的一种简易方法。c. 化学发光测定法：中性粒细胞在吞噬过程中出现呼吸爆发,产生活性氧代谢产物。此类活性氧化基团与细胞内杀菌作用密切相关，同时又能激发细胞内某些物质产生化学发光。(3) 巨噬细胞细胞毒测定：通常取小鼠腹腔巨噬细胞，以-干扰素为激活剂使其活化，作为效应细胞。用125I-UdR 标记的DBA/2 小鼠肥大细胞瘤P815 作为靶细胞。(4) 巨噬细胞吞噬功能测定5. 宿主抵抗力试验用来评价受试动物体液或细胞介导的免疫系统抵御病原性微生物感染或抵抗肿瘤发生及转移的整体免疫能力。感染因子有肿瘤细胞、细菌、寄生虫等。宿主抵抗力试验是药物免疫毒性评价的最后一步。6. 变态反应相关试验Buehler 试验豚鼠最大化试验(GPMT) 小鼠耳肿胀试验小鼠局部淋巴结试验(LLNA) 皮肤光变态反应试验新技术、新方法在免疫毒理学中的应用CFSE 标记淋巴细胞转化试验羧基荧光素乙酰乙酸（CFSE ）标记淋巴细胞转化试验：本试验采用一种可结合在细胞膜表面的荧光染料，细胞每分裂1次，CFSE 的荧光强度减弱一半。这种方法不仅可以检测单细胞水平上细胞分裂的次数，还可以确定细胞的增殖能力，得到与增殖相关的多项参数，结果既直观又可量化。另外该法引入了流式细胞仪技术，使得检测更为准确、快速，是传统淋巴细胞增殖试验的可能替代方法之一。流式细胞术(FCM) 流式细胞术(FCM) 已经广泛应用于免疫毒理学研究，能对各种细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK 细胞、巨噬细胞、树突状细胞等进行客观、快速、灵敏、多参数定量测定，并能按要求高纯度地分离收集所需类型的细胞。FCM 能以每秒1 000 ～10 000 个细胞的速度分类收集无菌细胞，且其活性不受影响。自身免疫相关试验胭窝淋巴结试验（PLNA ）是通过检测胭窝淋巴结的重量或细胞数的改变来观察外源化学物质引起自身免疫反应的现象。包括直接法、间接法和过继转移法。凋亡检测凋亡(细胞程序性死亡)是健康和疾病状态以及机体对外源性物质反应的基本过程之一。凋亡在免疫反应中起着关键的作用，可以调节淋巴细胞的数量和作用方式。鉴于凋亡在免疫系统调控中发挥的重要作用，所以它可能是免疫毒理学机制研究较具潜力的评价终点。检测凋亡有许多技术，包括DNA 降解技术、流式细胞检测、形态学分析、3’一OH 末端标记和核内切酶分析。细胞因子测定细胞因子在免疫系统功能调节的机制中发挥着重要作用，是免疫系统与其他系统之间联系的纽带。许多研究表明药物免疫毒性与一些细胞因子的表达相关，如能引起过敏的药物会引起细胞因子的表达上调，免疫抑制剂则导致细胞因子的表达下降。目前开展的细胞因子研究方法有基于生物分析、免疫分析、mRNA 基因表达、流式细胞术等的角质细胞系中变应原活性分析、全血细胞因子测定以及荧光细胞芯片测定法等。检测细胞因子的方法：生物学测定也叫生物活性测定，主要根据各种细胞因子的不同生物活性检测。免疫学测定是目前使用最为广泛的方法，主要利用细胞因子蛋白或多肽的抗原性，获得特异性抗血清或单克隆抗体，利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。其中常用的有酶联免疫吸附试验（ELISA ）、放射免疫试验（RIA ）和免疫印迹（Immunoblot ）等，尤以ELISA 最为常用。流式细胞仪检测的基本原理是用荧光标记的抗细胞因子抗体标记细胞，在流式细胞仪上观察荧光染色细胞的数量、比例和荧光强度等。分子生物学方法可