免疫比浊分析技术原理与进展桂林英美特生物技术研究所一、免疫学基本原理二、免疫沉淀三、免疫比浊技术原理一、免疫学基本原理1、抗原与抗体2 、抗原抗体的结合——免疫学反应3 、免疫学反应的检测技术1、抗原与抗体抗原（Antigen, Ag ）是刺激机体产生免疫应答的物质。“应”是指抗原刺激机体产生免疫应答产物-- 抗体或免疫效应细胞“答”是指相应抗原与免疫应答产物结合并将其排除体外）抗原的免疫原性和免疫反应性完全抗原与半抗原抗原表位与抗原结合价位1、抗原与抗体1、抗原与抗体免疫原性免疫原性（immunogenecity ）是指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特异性抗体及免疫效应细胞）的性质。1、抗原与抗体免疫反应性：是指抗原分子与免疫应答产物（抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性质。1、抗原与抗体完全抗原（complete antigen) 具有免疫原性和抗原性的物质。半抗原（hapten ，又称不完全抗原incomplete antigen ）无免疫原性，只有抗原性的物质。载体（carrier ）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。半抗原+ 蛋白质（载体）＝完全抗原。1、抗原与抗体抗原决定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR 或抗体Fab 片段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。构象决定簇：构象决定簇（conformational determinant ）由空间构象形成的决定簇，序列上不连续。顺序决定簇：顺序决定簇（sequence determinant ），又称线性决定簇（linear determinant ），序列相连续的氨基酸肽片段构成的决定簇。抗原结合价：抗原结合价（antigenic valence ）是指能够与抗体分子结合的决定簇数目。1、抗原与抗体1、抗原与抗体抗原表位的性质、数目、位置、空间排列和立体构象决定着抗原-抗体反应的高度特异性。1、抗原与抗体共同表位（common epitope ）指不同抗原之间含有的相同或相似的抗原表位。交叉反应（cross-reaction ）指抗体或致敏淋巴细胞对具有相同或相似表位的不同抗原均具有的反应（交叉结合）。1、抗原与抗体抗体（antibody, Ab ）功能性概念是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig ）结构性概念具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。抗体一定是球蛋白，球蛋白未必是抗体1、抗原与抗体1、抗原与抗体“Y”型，四肽链重链（5种: 、、、、）轻链（2种: 、）可变区（V区）超变区（又称CDR 互补决定区）骨架区: FR 恒定区（C区）铰链区1、抗原与抗体根据重链抗原性的不同，免疫球蛋白可以分为5类：IgG —γ(gamma) IgA —α(alpha) IgM —μ(mu) IgD —δ(delta) IgE —ε(epsilon) 1、抗原与抗体根据轻链C区抗原性不同，免疫球蛋白可分为2型) κ(kappa ) 型λ(lambda ) 型轻链存在于各类免疫球蛋白中同一个免疫球蛋白分子中的轻链同型1、抗原与抗体抗体的生物学功能——特异性结合抗原超变区－表位静电力、氢键、范德华力可逆影响因素：PH 、温度、电解质2、抗原抗体的结合——免疫学反应抗原抗体反应的原理抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH 、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。抗原抗体的结合使电荷减少或消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。四种分子间引力（电荷引力、范登华引力、氢键结合力和疏水作用）参与并促进抗原抗体间的特异性结合。2、抗原抗体的结合——免疫学反应典型的抗原抗体结合反应2、抗原抗体的结合——免疫学反应抗原抗体反应的特点2、抗原抗体的结合——免疫学反应2、抗原抗体的结合——免疫学反应影响抗原抗体反应的因素电解质（离子强度）：抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85 ％氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+ 和C1 －，可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势（12 ～15mV ）以下时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。酸碱度（pH ）：抗原抗体反应必须在合适的pH 环境中进行。蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在pH 为6～8进行。PH 过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质，例如pH 达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应。温度：在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56℃时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；在40℃时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。常用的抗原抗体反应温度为37℃。每种试验都有其独特的最适反应温度，例如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。其它：适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。3、免疫学检测技术凝集与沉淀比浊电位、微天平二、免疫沉淀凝集：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反应（agglutination ）是最经典的免疫学检测技术。二、免疫沉淀免疫沉淀反应:(precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下发生结合，出现的沉淀现象。凝胶内沉淀试验——平板法三、免疫比浊技术原理当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。三、免疫比浊技术原理免疫比浊技术分类：透射免疫比浊法（transmission turbidimetry 透射免疫比浊法溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm) 溶液中形成的复合物分子要足够多控制抗原抗体反应的温度和时间加增敏剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A) 为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上绘出标准曲线透射免疫比浊法灵敏度较低。要求抗原－抗体复合物分子应足够大、足够多，分子太小则入射光直接通过。加增敏剂。直线光路，灵敏度有先天缺陷。设计散射比浊。透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测仍需抗原－抗体温育反应时间，检测时间较长。散射免疫比浊法抗原抗体复合物对一定波长的光产生折射、偏转，偏转角度及散射光强度与复合物粒子的大小和量有关散射免疫比浊法定时散射比浊分析散射免疫比浊法速率散射比浊分析粒子增强免疫比浊分析技术基本原理选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒吸附或交联抗体后，当遇到相应抗原时，则发生聚集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳颗粒凝聚时，则使透射光减少，这种减少的程度与胶乳凝集成正比，当然也与抗原量成正比。特定蛋白分析仪简介以免疫比浊法原理设计的特定蛋白分析仪有1970 年Immuno Preciptin ）、1977 年BEHRING 公司开发的BL （(Behring Laser Nephelometer) ）、而后该公司又先后于1985 年研制出BN （Behring Nephelometer Analysers ）、1987 年研制出TTS （Turbi Time System ）和1988 年开发出BN-100 （Behring Nephelometer 100 ）），美国BECKMAN 公司也在80 年代推出ARRAY360 和ARRAY360E 两种型号的特定蛋白分析仪，德国宝灵曼公司也同时推出KeySys 特定蛋白分析仪，最近2000 年DADE BEHRING 公司又将BN-100 升级为BN Prospec 。特定蛋白分析仪简介当抗原（待测物质）含量过高时，可能出现前带现象，也就是钩状效应。此时，由于抗原、抗体比例不符合免疫反应的最适比例，而不发生反应，不能形成免疫复合物，造成反应结果的假阴性。容易受待测标本，如血浆本身浊度的影响。当有明显脂肪血、黄疸或溶血时，本身就有一定的浊度，尤其在待测物质含量较低的情况下可造成假阳性。伪浊度的干扰。产生伪浊度的原因主要有（１）抗体（试剂）的质量，如试剂中含有非特异性的交叉反应性抗体、试剂被污染或变质。（２）试剂中填加的增浊剂浓度过高。（３）反应时间掌握不当，如速率法反应时间过长，终点法时出现絮状沉淀。（４）样品处理不当，如发生溶血。（５）比色杯质量不合格或长久使用清洁度下降。特定蛋白分析仪简介速率信号的获取性能抗原过剩的监测性能胶乳粒子增强技术小结免疫比浊分析技术是传统免疫沉淀技术与比浊分析技术的结合免疫比浊分析技术主要有透射免疫比浊分析和散射免疫比浊分析两种速率测定和胶乳粒子增敏是免疫比浊分析的发展方向全自动生化分析仪和特定蛋白分析仪是免疫比浊分析的两个重要应用载体，均可实现全自动化分析1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 各管抗原倍比稀释加入抗血清各管抗体量不变振摇混匀、37℃孵育沉淀量不同试管内絮状沉淀试验轻摇絮状沉示意图淀Ag Ab Ag Ab Ag 凝胶内沉淀——试管法单向琼脂扩散试验标准品抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定原理将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。凝胶内沉淀——双向琼脂扩散原理示意图Ab Ag 模拟图染色琼脂图1. 抗原抗体双向自由扩散2.24 小时出结果3. 呈现沉淀线或弧检测器光源透镜滤光片平光线散射透射光λ光波比浊测定法原理示意图d 当复合物大于入射光波的1/20 时，形成不对称前向散射，在90o 以前的角度测量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表复合物的量当复合物小于入射波长时呈全透射，透射与散射相当按光路透射免疫比浊散射免疫比浊按测定时间终点比浊速率比浊按增敏剂无增敏PEG 增敏胶乳增敏透射比浊法和散射比浊法光路检测器A 检测器B IC I0 IθI θ透射比浊法散射比浊法透射免疫比浊法是在180° 角，即在直射角度上测定光透射强度。散射比