生物技术药物的免疫毒性和免疫原性研究Kaiyong LIU  华南农业大学生物技术药物生物技术药物包括体内诊断、治疗与预防用途；来源于细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞蛋白质、多肽及其衍生物、核酸如细胞因子、生长因子、融合蛋白、酶、激素、单抗、载体等特殊性结构、生产工艺、保存条件、同源性、作用靶点明确等固有的特点免疫毒性/免疫原性免疫毒性是指受试品引起免疫抑制或增强、过敏反应或自身免疫反应，可能与药理活性相关（如抗排斥药物）或不相关（如部分抗肿瘤药物）。免疫原性指药物刺激机体形成特异性抗体或致敏淋巴细胞的性质。研究意义意义重大：如免疫抑制，感染↑，肿瘤↑免疫增强，放大自身免疫反应或过敏反应。免疫原性，是药物本身具有的性质，有免疫原性不一定导致毒性，但可以影响对药物毒性、毒代或药效的客观评价。但在规范及指导原则方面，缺乏共识，实验方法也不统一免疫毒性研究内容一常规的免疫毒性指标包括：白细胞总数及其分类计数球蛋白和白/球比值补体水平淋巴器官/组织的大体解剖胸腺和脾脏的器官重量免疫病理：胸腺、脾脏、引流淋巴组织免疫毒性研究内容二额外的免疫毒性试验（additional studies ），如(1) 常规免疫毒性检测结果提示免疫毒性，感染↑(2) 受试品的结构，与已知免疫调节剂相似(3) 药代动力学结果:原型药或代谢产物在免疫组织蓄积(4) 适应症:如用于抗HIV 药物(5) 药理作用：常对免疫系统有影响常规的免疫毒性检测结果  —引流淋巴组织检查常规的免疫毒性检测 —免疫抑制/增强全血细胞变化、白细胞变化或淋巴细胞变化等。免疫器官重量改变或组织学检查显示相关器官或组织细胞密度变化血清免疫球蛋白变化用药组感染发生率升高用药组肿瘤发生率增多(除遗传毒性、激素效应或肝酶诱导外) 额外的免疫毒性试验内容免疫功能检测如T细胞依赖的抗体反应、NK 细胞活性、CTL 活性、细胞因子表达、巨噬细胞/中性粒细胞功能、皮肤超敏反应、宿主抵抗力研究）免疫表型检测依据免疫学理论和具体靶分子种类额外的免疫毒性试验方案增设卫星组、增加免疫学指标或改变给药方案等。发育免疫毒性：在成年动物中发现免疫抑制作用后，需要评价发育免疫毒性作用，如观察母代暴露于药物后仔代的淋巴系统、血液系统、细胞因子等，两种以上功能检测等。不仅是免疫抑制！常规阶梯或分层或标准试验组合不一定合理，需个体化额外的免疫毒性试验方法免疫功能检测额外的免疫毒性试验方法免疫功能检测额外的免疫毒性试验方法免疫表型检测常用流式细胞仪检测，检测表达水平和比例免疫功能检测 —分泌IFN γ细胞免疫细胞表型检测 —CD22 阳性比例免疫细胞表型检测 —CD4/CD8 比例免疫毒性试验结果分析统计学意义与生物学意义（尤其单一指标）变化程度与剂量/暴露关系与拟用临床剂量的关系疗程关系涉及动物种属数量和受影响的终点可能继发于其他因素(e.g., stress, ）可能的细胞靶点和（或）作用机制引起这些变化的剂量与产生其他毒性的剂量关系可逆性免疫毒性靶器官的分析线索靶分子在免疫器官或组织的分布受试品或其代谢产物的分布相关指标的变化—常规免疫指标、细胞因子变化等。免疫毒性机制推测受体或药靶直接引起的毒性反应（on-target) —如干扰素引起骨髓抑制受体或药靶介导的间接毒性反应—如rhIL-12 能诱导干扰素的分泌非特异机制—如rhTNK-tPA 引起肝细胞剂量依赖性的脂肪变性。免疫原性研究内容免疫原性(immunogenicity) 指诱导宿主产生免疫应答的能力，具有这种能力的物质称为免疫原(immunogen ）。产生特异性抗体或致敏淋巴细胞能力。影响因素分子大小，10 000 ，5 000 ～10 000 ，1000 ～5000  分子结构，蛋白质＞多糖＞核酸＞类脂宿主因素、免疫方式免疫原性研究意义免疫原性影响重复给药毒性试验结果的分析：中和药物活性、改变药物的清除、半衰期和组织分布（neutralize drug activity and alter drug clearance, plasma half-life, and tissue distribution ）建立免疫分析方法，供临床试验应用免疫原性研究内容抗体检测方法学验证免疫反应检测抗体滴度、抗体的出现时间、出现抗体的动物数、剂量关系、抗体滴度的动态变化、抗体的中和活性、。抗体与药代/药效和安全关系的评价同期的药效/药代（毒代）/毒性反应的变化、补体激活与否、免疫复合物在肝肾的沉积、是否需要终止给药、临床意义分析等抗体检测方法ELISA- 桥法包被药物，用标记的药物检测。ELISA- 直接法包被药物，用标记抗体检测。（缺点：包被时可能会掩盖或改变药物的表位，仅检测单一亚型，有种属特异性，多次洗涤时丢失低亲和力抗体，参考品与样本之间试剂可能不同）抗体检测方法间接法包被单抗或生物素，再加药物。放射免疫沉淀法（RIP ）液相法，中等或高通量水平表面等离子体共振液相法，不需结合物（酶标记抗体），能检测到不同亲和力的抗体和各亚型抗体电化学发光法液相法，可检测各种抗体亚型抗体检测方法考察方法学考察　—灵敏度：500-1000ng/ml ，低滴度抗体检出　—受试物干扰：如有文献报道，如血清中受试物浓度大于0.15μg/ml ，则难以检测到抗受试物抗体。一般从1：10 开始稀释或对样品进行处理。长效? 　—精确度：利用阳性对照品重复测量—阴性对照血清一般需从15 只动物或50 人中抽取免疫复合物在肝肾的沉积抗体检测结果描述抗体滴度结果表示数据呈非正态分布，取对数后达正态分布，需用几何均数表示抗体检测结果抗体的出现时间、出现抗体的动物数、剂量关系、抗体滴度的动态变化抗体中和活性检测常用依赖细胞株抗病毒致细胞病变（CPE ）克隆细胞株靶基因检测等。游离或与抗体结合的受试品对中和活检测的干扰（偶联抗体的琼脂糖凝胶珠吸附）抗体中和活性的检测  —CPE 法抗体中和活性检测方法 —靶基因表达抗体产生对药效相关指标的影响抗体产生对药代的影响临床上连续应用重组水蛭素5ｄ以上可使74% 的患者产生抗水蛭素抗体（AHAb ）。抗体产生对药代的影响抗体产生对毒性反应的影响中和抗体产生对给药方案的意义中和抗体影响了大多数动物的药理和（或）毒性反应，则可以考虑终止给药。中和抗体水平，在体外能中和安全剂量达到的血药浓度的作用时，可以考虑终止给药。需结合药动学资料。总结生物技术药物免疫毒性评价—重视，个体化原则，采用新方法生物技术药物免疫原性评价—强调规范，分析与毒性反应等关系CD28 激动剂TGN1412 的Ⅰ期临床试验事件德国公司研制的抗CD28 超级激动剂TGN1412 （人源化单抗）用于治疗白血病等，在1期临床试验中，单次静脉注射12-16h ，6例均出现严重不良反应（多器官衰竭）。CD28 激动剂TGN1412 的Ⅰ期临床试验事件研究发现注射受试品后很快导致前炎症因子释放（细胞因子风暴），心肺功能衰竭。猴长毒：CD4+ 和CD8+ T 细胞一过性升高,血清IL-2 、IL-5 、IL-6 中度升高，但没有出现细胞因子释放综合征。CD28 激动剂TGN1412 的Ⅰ期临床试验事件的教训Ⅰ期临床试验方案的教训：仅10min 间隔免疫毒性的种属差异及免疫毒性评价和分析的重要性（Toxicol in Vitr ）。猴并非一定是相关动物，动物记忆T细胞少。主要参考文献EMEA. Guideline on Comparability of Medicinal Products Containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substance: Nonclinical and Clinical Issues ICH. preclinical safety evaluation of 　biotechnology-derived pharmaceuticals 　s6 ICH. immunotoxicity studies for human pharmaceuticals s8 FDA.Immunotoxicology Evaluation of Investigational New Drugs 吕秋军等. 生物技术药物临床前安全性评价研究进展。中国新药杂志，2001 ，10 （4）：252-256 Lu Qiujun, et al. Safety evaluation of recombinant staphylokinase. Toxicologic Pathology,2003 ，31 （1）：14-21 吕秋军. 生物技术药物免疫原性的评价及面临的挑战. 中国新药杂志,2007, 16(3):181 -188  0 4 8 13 17 21 0.01 0.1 1 10 TPO ( ng / mL ）- ) 时间( 天) 图猴皮下连续注射rhTPO 2 g.kg-1.d-1  20 d 后血清rhTPO 浓度( 实测值和抗体滴度( , 血清稀释倍数的倒数）图食蟹猴sc 2 周和4周PEG-IFN 后白细胞计数、抗体滴度和血清中和活性** ** * * ** *** *** *** * 图　猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后回肠粘膜下集合淋巴小结ＡＢＡ：对照组，Ｂ：高剂量组ELISA 法及胞内细胞因子检测Cytokines 51Cr 释放法，ELISPOT 法CTL SRBC or 钥孔血蓝蛋白(KLH ），用ELISA 等TDAR 反映天然免疫功能NK 荧光标记的胶珠观察phagocytosis 等Macrophage/Neutrophil 抗感染或抗肿瘤发生（整体，必要时）host resistance PLNA （报告抗原TNP-Ficoll 、TNP-Ovalbumin ）autoimmunity  Buehler 试验、豚鼠最大化试验（GPMT ）、小鼠耳肿胀试验、小鼠局部淋巴结试验(LLNA) 目前预测IV 型变态反应hypersensitivity 注：GPMT 与人一致性约70% ，LLNA 约72% Immature T cells CD8+CD4+ T Suppressor-cytotoxic cells CD8+CD4- T Helper/delayed-type hypersensitivity cells CD4+CD8- Pan T cells 、Thy 1.2+ or CD3+ PanB cells sIg+ marker Surface 图　　猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后外周血p24 特异性的分泌IFN －γ的淋巴细胞数量图食蟹猴静脉注射SM03 嵌合抗体后CD22 标记阳性细胞率的变化CD22 阳性细胞比例（%）CD4/CD8 比例图猕猴iv 4 周LHRHA-PE38 后外周血CD4/CD8 比例Ａ：溶剂对照组猴肾组织Ｂ：重组葡激酶大剂量组肾组织ＡＢ图　猕猴iv 重组葡激酶４周后肾组织的免疫组织化学染色图　猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后血清对HIV-1 HN 024 的中和活性图注射表达EPO 基因裸质粒8周后贫血大鼠HCT 、EPO 水平及中和活性的检测*  Sheet3
Sheet2
Sheet1
Chart1
溶媒对照25 MKD
75 MKD
225 MKD
 给药12周12.53±4.29
0.10±0.06***
0.12±0.05***
0.33±0.21***#$
 停药4周13.40±8.98
0.18±0.13
0.11±0.08
Control
12周恢复期4周25mg/kg
75mg/kg
225mg/kg
0.00
.00
.00
.00
0.00
.00
.00
.00
12周恢复期4周12周恢复期4周Control
Control
25mg/kg
25mg/kg
75mg/kg
75mg/kg
225mg/kg
225mg/kg
0.00
0.00
.00
.00
.00
.00
.00
.00
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Sheet2
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Chart1
对照组低剂量中剂量高剂量.00