实验动物与肿瘤研究 一．实验动物experimental animals （一）概念：用于实验研究的动物，即能为实验研究提供有关数据和资料的动物，称为实验动物。实验动物是按照研究的目的、要求而进行驯养、繁殖、培育成的动物。(一）意义：实验动物受到世界各国普遍高度重视，在生命科学领域内，不能用人进行实验，必须借助实验动物来研究：1 ．探索生命的起源。2. 攻克恶性肿瘤的堡垒：对它的研究包括：a. 恶性肿瘤发生、发展。b. 治癌方法的探索及疗效的验证：外科手术、放疗、热疗、超声聚焦、冷疗、化疗、激素疗法、生物免疫疗法、基因治疗等。针对肿瘤细胞，针对肿瘤周围细胞如肿瘤血管内皮细胞、成纤维细胞，针对肿瘤血管形成等方法进行治疗。c. 抗肿瘤药物的筛选、研究和试用。d. 肿瘤转移的机制与防治、控制。e. 肿瘤监测手段的建立和完善：肿瘤标志物检测、普查、早期诊断。f. 肿瘤患者的生存质量检测3．揭示遗传的奥秘：克隆羊的诞生。4 ．研究人类各种疾病与衰老的机制。5 ．探求艾滋病、病毒性肝炎的防治方法。6 ．监测公害、防止环境污染，保护人生存环境及生产优质畜牧品，为人类服务。（三）分类：（按遗传学控制原理分类） 1．近交系动物（inbreed strain ）又称纯系动物(inbrod line) 是采用“兄妹”交配或“亲子”交配，连续繁殖20 代而培育出来的纯品系动物。⑴近交系动物的特征：①基因纯合性：基因高度纯合化，纯合子的纯度最高点有98.6 ％基因已完全纯合。在一个近交品系内所有动物的各个基因位点都应当是纯合子。②基因稳定性：基因高度纯合，因而减少了遗传变异，基因型可长期处于稳定状态。如DBA 系小鼠已维持了60 年，C57BL 系小鼠已维持了50 多年，至今仍与原品系极为相似。③同基因性：基因高度纯合和基因型相当稳定，而使得个体间极为相似，即同一品系内具有基本相同的遗传组成和遗传特点，也就是基因型相同。④同表现型：表现型是基因在环境因素作用下表现出来的、可被直接观察到的性状。由于同基因性，所以其表现型是均一的，反应性是一致的。（对实验比较重要，可以统计某一因素的作用等）⑤个体性：由于不同品系都具有不同的遗传组织和生物学特性，不同品系各有不同的特性。如615 、DBA 、C57BL 、BALB/C 小鼠。⑥分布的广泛性：近交系动物在国际上广泛分布，有可能在世界各国之间进行比较研究。⑦资料可查性：最常用的品系都有相当数量的背景资料。这是最有价值的特点。⑧可分辨性：每个近交系动物都有自己独特的生化标志、基因等特点，可定期检测动物是否可靠。⑵近交系小鼠遗传学监测：常用的有：皮肤移植法、毛色基因测试法、下颌骨形态分析法、生化标志监测法、醋酸纤维薄膜电泳（蛋白质及同功酶电泳法可以检查近20 个基因位点，容易反映出被检品系遗传概貌，如亲子鉴定）、混合淋巴细胞试验、组织相容性基因监测等。2 ．突变系动物mutant strain 指保持有特殊的突变基因的品系动物。即正常染色体的基因发生了变异，并能保持变异基因特性的品系称为突变品系，如裸鼠。一般通过自然和人工定向突变，如敲除某些基因而复制出各种类似于人类遗传缺陷病的动物；如基因转染而复制出类似人类疾病的动物。为人类疾病防治研究需要培育的品系。目前发现小鼠突变基因648 个，培育突变系小鼠有350 多个品系，已被广泛应用于肿瘤等研究。裸鼠(nude) ：先天性胸腺缺陷的突变小鼠。20 世纪60 年代发现了带有常染色体隐性裸基因(nu) 的裸小鼠，寿命短。1968 年培育出纯合子nu/nu 胸腺缺乏裸小鼠，造成细胞免疫缺陷有利于异种组织的移植成功。1969 年首例人体恶性肿瘤移植成功，3.5-5.5 年内移植瘤可传27 －56 代，仍保持人类恶性源肿瘤的特点。裸小鼠模型可以用作致癌机制研究及肿瘤组织的发生、免疫学、细胞动力学等肿瘤基础理论研究和抗肿瘤药物的敏感性试验等多方面研究。在激素内分泌治疗、放射治疗的疗效研究、单克隆抗体的大量生产等都有不可估量的价值。70 年代裸大鼠种子群在英国MBC 实验动物中心建立，它具有移植瘤大、取血量多、可施行某些外科小手术等比裸小鼠有一定的优越性。1986 年我国马曾辰报道两株世界首次裸大鼠人肝癌模型的建立和生物学特性的观察。转基因动物transgenetic animal 在基因组中稳定地整合由人工导入的外源基因，并能遗传给下一代的一类动物称为转基因动物。将特定的目的基因从某一动物分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。转基因动物的研究方法：按基因导入方式建立转基因动物主要方法有显微注射法、反转录病毒法、体细胞克隆法、精子载体法。科学家已经建立了各种人类疾病的转基因小鼠：如老年痴呆症、肌肉营养缺乏症、心力衰竭、病毒性肝炎、高血压、动脉硬化症、关节炎、内分泌功能障碍、视网膜母细胞瘤、艾滋病等。视网膜母细胞瘤：转入的基因是黄体生成素（luteinizing hormone ）β亚基的启动子驱动的SV40 病毒的T抗原基因，5个月后转基因小鼠开始出现视网膜母细胞瘤。转基因小鼠中二个视网膜母细胞瘤基因并未突变，转入基因中的SV40 病毒的T抗原可以与视网膜母细胞瘤基因编码蛋白Rb 相结合，从而大大降低了Rb 在细胞中的水平，导致视网膜母细胞瘤发生。1987 年将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，植入代孕母鼠中，获得比普通小鼠生长速度快2－4倍、体型大一倍的转基因“硕鼠”。转基因动物技术轰动了整个生命科学界，它使人们看到利用此技术在建立人类疾病模型、加速动物育种、研究真核生物基因表达、调控机制以及在哺乳动物特异组织系统内生产人的药用蛋白等方面崭新的前景。此后转基因兔、羊、猪、牛等培育成功。在肿瘤学、免疫学、遗传学等方面也有重要意义。3 ．杂交系动物hybrid strain 也称杂交一代动物，是两个近交系动物之间进行有计划交配所获得的第一代动物，简称F1 动物。个体与个体之间杂的都一样，所以个体之间基本上有相同的遗传型和表现型。它的优点：①具有杂交优势：生命力、适应性和抗病力强，繁殖旺盛等可克服近交系繁殖所引起的近交衰退现象。②具有基本相似遗传性，基本具有近交系特点。③具有亲代双亲特点。④各种实验结果重复性好。⑤国际上分布广，实验结果便于各国交流及进行重复。4. 封闭群动物closed animal 一个动物种群在5年以上不从外部引进其他任何品种的新血缘，而由同一血缘品种进行随意交配，在固定场所进行繁殖的动物群，称为封闭群动物。它避免“兄妹”、“亲子”、“表兄妹”、“侄伯”之间的相互交配，在动物群中的个体之间具有某些程度的遗传差异，基因多态性。这样既保持群体的一般性，又保持动物的杂合性。如动物中心饲养的昆明种小鼠。它的优点：①避免了近交衰退的出现，能保持相当程度的杂合性。②生活力、生育力都比近交系强。③在观察筛选某一药物时，它可反映综合的平均疗效。普人工导入外来基因转基因小鼠↓通特殊基因突变突变系小鼠小5 年以上不从外引进新品系封闭群小鼠鼠兄妹、亲子交配20 代近交系小鼠↓杂交杂交系小鼠实验小鼠之间关系（四）分级：Ⅰ级动物：为普通动物，用于教学示范的动物。Ⅱ级动物：为清洁动物，用于一般的动物实验。Ⅲ级动物：为SPF 动物（无传染病的健康动物）。Ⅳ级动物：为无菌动物或悉生动物（体内带有已知微生物或寄生虫的动物）。（五）标准化：标准化的内容包括对实验动物进行遗传学、微生物学、寄生虫学、营养学、环境生理学等方面的监测和控制，用科学的方法培育和使用动物。二. 实验肿瘤的研究（一）概念：利用实验动物进行整体水平的肿瘤研究，称为实验肿瘤研究。生物体是一个复合的整体，各种器官、组织之间既有区别或相对独立性，又有不可分割的相互联系，因此整体水平的肿瘤研究更加受到肿瘤学家重视。实验肿瘤研究已成为肿瘤研究中极其重要的一大领域，它研究的主要对象和材料是实验动物，为人类防治肿瘤提供各种参考材料。实验肿瘤研究中实验动物和实验肿瘤模型是最基本、最重要材料，（二）实验动物的选择：各类实验动物的特点不同，不能随便选用一种动物来进行实验，因为在不适当动物身上进行实验，常常会得出不适当的结论。实验动物选择首先根据实验目的，其次考虑实验动物是否容易获得、是否经济、是否易于饲养管理、是否容易操作等因素。1. 选用实验动物作实验时遵循一般原则：①一定要选择结构功能代谢尽可能与人类接近：如高级N活动的实验研究时，多选用猴、猩猩、犬、猫，而不能用蛙；在肿瘤热疗中进行的热耐受的研究最好用猪，因为猪除了心功能比人类弱外，其他如皮肤组织结构、脂肪厚度、血液生化指标、代谢等与人类相似，而且完全可以选用体重与人相近的猪。②一定要选择对某物质最敏感的动物作为实验对象：研究致癌物质作用时宜用大鼠、小鼠；复制动脉粥样硬化动物模型常选用容易形成这种病变的兔、鸡、鸽、猴等。③一定要考虑选择实验动物种系特点（高肿瘤发病率、低肿瘤发病率）、生理状态（怀孕、授乳）、性别、年龄等。如要说明药物对妊娠及后代在胎内、产后的影响，选用妊娠的大、小鼠。2. 肿瘤研究的实验动物选用的方法：（根据实验动物各品种特点）①大鼠的肝对致癌物质的作用很敏感，通过大鼠肝癌研究已积累了大量的有关肝癌病因学、发病学和分子生物学等方面的资料。②小鼠肿瘤在组织发生上、临床过程和组织形态学上都与人类的肿瘤有相似之处，因此实验肿瘤研究常选用小鼠，尤其是各种高癌品系（615 系、AKR 系、DBA 系小鼠容易致白血病，C3H/He 、津白2号、A系小鼠容易致实体瘤）；低癌品系（津白5号、C57/BL 系不容易致癌）近交系小鼠。为研究遗传因素在某种肿瘤发病中作用（如乳腺癌），需要选用高乳腺癌品系小鼠（C3H/He ），并与低乳腺癌品系小鼠（BALB/C 、C57/BL 系）进行比较。为了获得某种病毒引发的肿瘤，就需要应用对这种病毒敏感的近交系动物。在实验肿瘤学研究中只要以实验动物为研究象，绝大多数情况下，以使用近交系动物为宜，这样做便于实验设计，使动物实验结果准确、均一、有可能重复再现。裸鼠已经在肿瘤移植术、肿瘤病因学、肿瘤免疫学、肿瘤实验治疗、肿瘤病毒学及化学致癌研究等实验肿瘤学研究中的许多领域得到了应用，但价格贵、饲养条件苛刻。在抗癌新药体内初筛时可选用封闭群动物，同种有个体差异、