W W W . W A T S O N W Y A T T . C O M 实验七细胞固定与染色技术我的邮箱bucmedu.@qq.com 一、实验原理1. 细胞固定的原理培养的细胞离开培养环境后会发生复杂的改变，失去正常的成分，结构被破坏，甚至坏死；而对细胞的观察和操作大多是不能直接在培养环境中进行的，所以要对细胞进行固定，从而最大程度的保持细胞生活时的状态。其主要原理就是用相应的固定液使细胞内的蛋白质变性、硬化，保持生活时原有的成分和结构。2. 细胞染色的原理细胞与周围背景没有明显的明暗差，所以通常观察到的细胞都是透明的，细胞的内部构造和成分都隐藏在背景当中，借助物理或化学的方法对细胞进行染色能够增强观察对象与背景的区别，帮助我们进行定性或定量观察。二、固定目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有：1 ．物理固定：如血膜空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片。2 ．化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构中的某些物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此，要根据实验要求和组化反应，选择最佳的固定方法和固定剂。如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。1.  碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核的染料。如亚甲蓝、天青。2.  酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧烷- 氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分等。3.  复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料（一）、染料（天然染料和人工染料）：将生物组织细胞和病原体染色，在显微镜下观察结构。发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被染组织亲合。细胞染色技术（二）、细胞染色原理：一般以它们的物理现象和/ 或化学现象为依据1. 物理作用：毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等2. 化学作用：a. 染料的化学成分：助色基团的存在，碱性染料在溶媒中为阳离子型，易与组织和细胞内带负电荷的酸性物质结合；而酸性染料在溶媒中为阴离子型，与带正电荷的碱性物质结合。b. 蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同数量的氨基（-NH2 ）和羧基（-COOH ），同时还有其他活性基团。在游离状态时，-NH2 获得一个H+ 变成带正电的-NH3+ ，而-COOH 失去一个H+ 变成带负电的-COO- 。分别与不同染料结合。c. 周围环境的酸碱度：如环境pH ＜pI （pI 为等电点），则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之，pH ＞pI ，则结合碱性染料。（三）、细胞染色法的类型1.  普通染色法：经物理和/ 或化学作用的吸附、结合2.  荧光染色法：荧光染料，荧光显微镜3.  细胞活体染色法：活体染料如灿烂甲酚蓝等4.  细胞化学染色法：用化学反应显示细胞内某种成分。细胞免疫化学染色法（应用单克隆抗体技术、酶标记技术）1 ．瑞氏染料酸性染料伊红（eosin, E- ）碱性染料亚甲蓝（methylene blue, M+ ；又名美蓝）组成复合染料。甲醇：溶解美蓝和伊红ME ；固定细胞的形态；提高对染料的吸附作用。注意：pH 值的影响细胞各种成分多属蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH 而定。在偏酸时正电荷（H ＋）增多，易与伊红结合，染色偏红。在偏碱时负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。染料贮存时间愈久，染色效果愈好。染液贮存，必须加塞，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。加入甘油, 防止甲醇挥发，染色清晰。瑞氏染色法（二）、试剂1. Wright 染液：瑞氏染粉0.1g, 甲醇60.0ml  甲醇：有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态，并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。2.  磷酸盐缓冲液（PBS ）：磷酸二氢钾（无水）0.3g ，磷酸氢二钠（无水）0.2g, 蒸馏水加到1000ml 。配好后用磷酸盐溶液校正pH ，塞紧瓶口备用。染色方法：a.  用蜡笔在细胞周围划圈，平放于染色架上。b.  加瑞氏染液覆盖细胞，固定1min 。c.  滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10 分钟。d.  用清水冲洗，待干后镜检。染色流程：勿冲洗再加瑞氏染色Ⅱ液5-8 滴后将Ⅰ液和Ⅱ液充分混允静置10 分钟直接流水冲洗3-5 分钟（切勿先到掉染液）涂片经水洗干燥后用油镜分类计数100 个白细胞李四123 固定干燥后加瑞氏染色Ⅰ液5-8 滴覆盖整个血膜1 分钟注意事项：a.  细胞要干透后才能染色，否则染色时易脱落b.  染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好。c.  染液不能过少，以防蒸发沉淀。d.  冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防染料沉着。冲洗时间也不能长。e.  染色过淡，可复染。f.  染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled ）或呈折缝样（creased ），部分染色质出现浓缩状态Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化Ⅱb 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。　　細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態改變This undated handout photograph shows a human embryonic stem cell colony, on a background of mouse embryonic fibroblast feeder cells, stained with Wright-Giemsa to highlight the individual cells of the colony.(Xinhua/Reuters Photo) 细胞核→核仁→成纤维细胞突起一、成纤维细胞（fibroblast ）为疏松结缔组织中最主要的细胞。细胞扁平或梭形，多突起；胞核较大，扁卵圆形，着色浅，核仁明显。胞质较丰富，呈弱嗜碱性。电镜下，细胞表面有粗短的突起，胞质富含粗面内质网、游离的核糖体和发达的高尔基复合体，表明该细胞合成蛋白质的功能旺盛。所合成和分泌的蛋白质等成分，构成了疏松结缔组织的各种纤维和基质。成纤维细胞功能处于静止状态时，称纤维细胞（fibrocyte ）。细胞变小，长梭形；胞核小，长扁卵圆形，着色深；细胞质少，呈嗜碱性。电镜下，胞质内粗面内质网少、高尔基复合体不发达。在创伤等条件下，纤维细胞可转变为成纤维细胞，形成新的细胞外基质成分。原本很少分裂的成纤维细胞也可进人增殖状态，参与组织修复。分两相进行，第一相是酸性伊红与细胞中的碱性物质如血红蛋白、嗜酸性颗粒结合；碱性染料天青B 与细胞中的酸性物质如核染色质、特异中性颗粒、血小板结合。第二相是天青B 和伊红结合在适宜条件下形成紫色的天青B- 伊红复合物，结果使白细胞核染色质成紫色（疟原虫的染色质成红色），中性粒细胞的颗粒及血小板颗粒区成紫色。W W W . W A T S O N W Y A T T . C O M 分两相进行，第一相是酸性伊红与细胞中的碱性物质如血红蛋白、嗜酸性颗粒结合；碱性染料天青B 与细胞中的酸性物质如核染色质、特异中性颗粒、血小板结合。第二相是天青B 和伊红结合在适宜条件下形成紫色的天青B- 伊红复合物，结果使白细胞核染色质成紫色（疟原虫的染色质成红色），中性粒细胞的颗粒及血小板颗粒区成紫色。